设施调控夜间温度对赤霞珠葡萄果实品质的影响

杨 洋，张小虎，张亚红,,*，李光宗，杨新宇

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

近年来，我国酿酒葡萄产业规模不断扩大，经过长期的发展，已逐步形成如新疆、贺兰山东麓、山东和京津冀等产区，各产区气候条件多样，产品各具特色。酿酒葡萄除品种和栽培技术外，产区气候、海拔、土壤特性等“风土”条件是影响浆果品质的重要因素[1]，其中气候影响最大[2]。温度是影响不同产区浆果代谢的主要气候因子。众所周知，昼夜温差大的地区，植物果实粒重较大，含糖量高。对酿酒葡萄而言，并不是昼夜温差越大越好，如新疆产区夏季夜间温度低，葡萄糖度高，但日间高温使酸发育不好，香气和着色都受到不利影响[3]。而山东产区夏季夜间温度高，糖度低，亦对葡萄酒风格不利。宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的夜间温度介于新疆和山东产区之间。因此，研究不同夜间温度对葡萄浆果品质及香气的影响，从另一方面可以解释3 个产区之间酿酒葡萄品质的差异性原因。

研究发现，温度对酿酒葡萄含糖量的升高和含酸量的降低均有促进作用，但高温会抑制葡萄的生长和发育，造成果实中有机酸和可溶性固形物含量的降低，降低葡萄果实的产量和品质[4]；葡萄花色苷主要是由品种所决定的，但其生物合成还受到气候因素、土壤条件等调控[5]，越凉爽的地区浆果产生的花色苷越多；采收前气温日较差越大，越有利于果实中单宁含量的增加[6]，但这些研究是针对气象因素对果实品质的影响，气候因素较多，导致容易忽视温度对品质影响的重要性。许多研究已经在转录水平上证实温度对葡萄浆果成熟和新陈代谢的影响。研究表明，在幼果生长期，温度升高会刺激糖的积累，从而加速苹果酸的降解[7-8]，减少花青素[9-10]和芳香物质[11]的合成。夜间温度对总可溶性固形物的影响较小，但对酸度、香气和花青素的影响较大[12]。研究结果表明，高温会阻碍酚类合成，夜间温度高对产量和品质的影响大于白天高温[13]。但这些实验是利用盆栽葡萄在气候室内进行[14-16]，或是在大田条件下对酿酒葡萄果实部位进行温度调控研究[8,17]。目前，鲜有关于夜间温度影响葡萄果实品质的研究报道。

本实验在葡萄园条件下，于葡萄藤上方搭建温室，采用空调调控设施内夜间温度的方式，研究不同夜间温度对葡萄果实品质的影响，以期获得夜间温度影响果实品质的机理，为不同产区生产高品质葡萄浆果、酿造风格独特的葡萄酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以6 a生欧亚种葡萄（Vitis viniferaL.）赤霞珠（Cabernet Sauvignon）为实验材料。栽培方式为南北行向，单臂“厂”字形整形修剪，每株4～5 个结果枝，株行距0.8 mh 3.0 m。实验于2019年5ü 10月在宁夏银川市宁夏大学葡萄酒学院葡萄教学标本圃进行。银川地处宁夏平原中部，在北纬37°29’～38°53’，东经105°49’～106°53’之间，海拔在1 010～1 150 m，年平均气温8.5 ℃，实验期间白天平均温度27.1 ℃，年平均日照时数2 800～3 000 h，年平均降水量200 mm左右，无霜期185 d左右，干燥少雨，光照充足，昼夜温差大，属于中温带干旱气候区。实验区土壤含砾石、沙粒，以淡灰钙土为主。

氯化钠、碳酸钠、盐酸、氯化钾、甲醇、蒽酮（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；邻苯二酚、单宁酸、福林-酚试剂、福林-丹尼斯试剂 无锡耐思生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FA-1004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；5804R低温冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UV757紫外-可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；100 μL PDMS固相微萃取针 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 搭建调控温室

图1 温室示意图Fig.1 Schematic geometry of the greenhouse

该实验在大田内葡萄植株上方搭建2 间温室，如图1所示，每间温室南北长度8 m，跨度2.8 m，高度2.5 m，顶部弧形高度0.6 m。温室采用装配式钢架结构，南北棚头采用阳光板密封，夜间温室顶部覆盖防水保温被便于控制夜温。为避免白天顶部遮阴，设计卷帘机从温室顶部东西两侧升放棉被。在温室内侧棚头中部1.9 m高度安装变频空调，并在空调侧下方0.8 m高度处安装换气扇，保持2 个温室内只有夜间温度不同，白天环境和大田一致。

1.3.2 调控温室内外气象参数

收集2014ü 2018年7、8、9月气象资料（数据来源于宁夏气象局），计算此期间平均夜间温度，以此夜间温度为参考，空调调控夜间高温（high temperature at night，HT，设置温度22 ℃）和夜间低温（low temperature at night，LT，设置温度17 ℃），自然环境为对照（CK），共3 个处理小区，每处理10 株葡萄，每株约8 穗果。夜间温度调控从浆果转色前10 d开始，共处理35 d。每晚日落后覆盖棉被并开启空调进行温度调控；次日早上日出前揭掉棉被并关闭空调；在每个处理小区内均匀设置3 组温湿度记录仪测定温湿度。实验期间3 个处理白天温度和光照等环境条件一致。从整体调控效果看，换气扇最大限度保证了各处理的湿度和CO2浓度相比自然条件没有显著变化，温度调控效果较为理想。不同处理气象参数值及夜间温度变化如表1和图2所示。

表1 不同夜间温度处理后气象参数值Table 1 Meteorological parameter values resulting from different night temperature treatments

图2 不同处理平均夜间温度变化Fig.2 Changes in average night temperature in different treatments

1.3.3 果实品质指标测定

从赤霞珠浆果转色后第5天开始采样，隔10 d采样一次。取样时每个处理从葡萄植株阴阳两面各随机选取3 个果穗，共取6 个果穗，取样放入冰盒带回实验室后，每处理分别从果穗上、中、下3 个部位随机剪取果粒100 粒，每处理3 个生物学重复。每处理取一部分鲜样用于测定果实可溶性固形物、可滴定酸；其余部分用液氮速冻后放入-80 ℃冰箱，用于测定总糖、单宁、花色苷、香气等。采用手持糖量计测定可溶性固形物含量；酸碱滴定法测定可滴定酸含量[18]；可溶性糖含量测定采用蒽酮硫酸比色法[19]；葡萄果实中总酚含量的测定采用福林-酚法[20]，单宁含量的测定采用福林-丹尼斯法[21]；花色苷含量用pH值示差法测定[22]；参考杨夫臣等[23]的方法测定类黄酮含量。

1.3.4 挥发性香气物质测定

由于不同夜间温度处理果实成熟时间不同，故待每个处理果实成熟时分批采样，用于测定挥发性香气物质。香气成分采用顶空固相微萃取方法提取，运用气相色谱-质谱联用技术分析，参照杨晓帆等[24]的方法并稍加修改。

前处理：称取适量液氮打磨样品置于顶空瓶中，加3 g氯化钠，密封，于80 ℃水浴平衡30 min，用固相微萃取针萃取30 min，待萃取结束后，萃取针在进样口解吸5 min。

色谱条件：色谱柱：HP-5MS（30 mh 0.25 mm，0.25 μm）；分流比：不分流；载气流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度45 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至200 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min速率升至250 ℃，保持4 min。

质谱条件：扫描方式为全扫描；离子源温度230 ℃；四极杆温度180 ℃。采集到的质谱图利用NIST谱库进行检索，鉴定样品中的挥发性成分，并利用峰面积归一化法分析各成分的相对含量。

1.4 数据处理

实验数据釆用Origin 2018软件进行显著性方差分析、绘图、主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）。

2 结果与分析

2.1 夜间温度对果实品质的影响

2.1.1 夜间温度对果实糖、酸含量的影响

表2 不同夜间温度处理后果实糖、酸含量变化Table 2 Changes in sugar and acid content of grape berries in different night temperature treatments

由表2可知，各处理可溶性固形物和可溶性糖含量在果实转色后初期迅速增加，于成熟期缓慢上升至最大；而可滴定酸含量相反，在初期迅速下降，之后呈缓慢下降趋势，于成熟时下降到最小。在5～25 d，可溶性固形物含量表现为LT＞CK＞HT，且不同处理之间差异显著；与CK相比，在转色后至成熟时，LT的可溶性糖含量增速最快且始终显著高于HT和CK，而LT可滴定酸含量的降解较减缓。最终，可溶性糖含量LT较CK显著提高了11.7%，可滴定酸含量LT较CK显著提高了16.1%，HT与CK无显著差异。

2.1.2 夜间温度对单宁和总酚含量的影响

图3 夜间温度处理后果实单宁和总酚含量的变化Fig.3 Changes in tannin and total phenol content of grape berries in different night temperature treatments

从图3可以看出，转色至成熟期不同处理单宁含量整体呈缓慢下降趋势，而总酚含量的变化，除在5～15 d略有上升，其余与单宁含量变化相似；在5～15 d，LT与HT之间的单宁和总酚含量无显著差异，但均与CK有显著差异；之后LT的单宁含量一直显著大于HT和CK。果实成熟时，LT的单宁含量较CK显著提高了16.5%，HT与CK无显著差异；总酚含量LT较CK显著提高了16.8%，HT较CK显著降低了19.1%。

2.1.3 夜间温度对花色苷和类黄酮含量的影响

葡萄果实从开始转色至成熟，是花色苷由出现到逐渐积累的过程。由图4可以看出，从转色至成熟时，各处理果实花色苷含量均呈上升趋势，且LT增幅最大。在15～55 d，果实花色苷含量始终表现为LT＞CK＞HT，且LT与CK之间存在显著差异；果实成熟时，LT较CK显著提高了51.7%，而HT与CK无显著差异。LT的类黄酮含量呈现一直上升的趋势，而HT和CK表现为先上升后下降再上升的波动趋势；最终，LT较CK显著提高了27.9%，HT与CK无显著差异。

图4 不同夜间温度处理后果实花色苷和类黄酮含量的变化Fig.4 Changes in anthocyanin and flavonoid contents of grape berries in different night temperature treatments

2.2 夜间温度对成熟时果实挥发性香气物质的影响

表3 夜间温度处理对果实挥发性物质种类及含量的影响Table 3 Effects of different night temperature treatments on composition and proportions of volatile compounds of grape berries

如表3所示，果实成熟时，各处理中均检测到醛类、酮类、萜烯类、醇类、酯类等挥发性成分，LT、HT和CK检测到的香气种类数分别为44、38、43。醛类是果实挥发性组分的主要成分。LT和HT的醛类化合物总的相对含量均高于CK；香气物质中的萜烯类和酯类化合物的相对含量较小，但其嗅觉感官阈值很低，对果实感官特性影响很大。较CK而言，LT显著增加了萜烯类和酯类化合物的相对含量和种类数；HT果实中未检测到烷烃类化合物。

如表4所示，不同夜间温度处理果实中检测到的共有挥发性物质11 种，其中5 种为醛类物质。具有青草香味的反式-2-己烯醛和乙醛的相对含量较高。在共有挥发性物质中，LT和HT果实中醛类物质总的相对含量分别为70.08%和73.45%，分别较CK高51.9%和59.4%。萜烯类化合物β-大马士酮在LT和HT中的相对含量均高于CK，分别约为1.6 倍和3 倍。

表4 不同夜间温度处理对果实共有挥发性物质的影响Table 4 Effects of different night temperature treatments on contents of volatile compounds common to different night temperature treatments

图5 夜间温度处理果实共有挥发性物质PCA（A）和PLS-DA（B）Fig.5 PCA (A) and PLS-DA (B) plots of volatile compounds common to different night temperature treatments

如图5A所示，PC1和PC2的贡献率分别为59.09%和39.70%，累计贡献率达到98.79%，能够反映果实挥发性物质的总体状态。3 个处理的果实样品可以被明显分开，PC1将HT和CK区分开，分别位于正半轴与负半轴；而LT位于PC2的正半轴，CK和HT位于负半轴。β-大马士酮对PC1的影响最强，其次为1-辛醇、辛醛、苯乙醇等；壬醛、反式-2-庚烯醛对PC2影响较强；因此，不同夜间温度对果实挥发性香气物质有显著影响。如图5B所示，夜间温度对反式-2-庚烯醛、壬醛、雪松醇、辛醛、1-辛醇影响较大，其得分均大于1.0，而其成分得分均在1.0以下。LT的反式-2-庚烯醛和雪松醇的相对含量大于CK，HT最小。HT的辛醛和1-辛醇相对含量大于LT，CK最小。

2.3 不同夜间温度处理赤霞珠果实品质综合评价

参考唐永红[25]的方法，利用OriginPro 2018软件对不同处理赤霞珠成熟时果实品质指标进行PCA，得到各PC相对应的特征向量及贡献率，如表5所示。提出2 个PCq1和q2，方差贡献率分别为89.14%和5.17%，2 个PC的累计贡献率为94.31%。根据PC理论分析，q1和q2两个PC已经能反映不同夜间温度处理赤霞珠果实的综合品质。

表5 不同夜间温度处理果实品质特征向量与贡献率Table 5 Characteristic vectors and contribution of principal components to the variance

根据表5，利用2 个PC各因子特征向量值及贡献率，可以建立PC及综合得分表达式：

式中：x1～x7分别代表标准化后的总糖含量、总酸含量、pH值、总酚含量、单宁含量、花色苷含量、类黄酮含量，Q为综合品质得分。

表6 不同处理赤霞珠品质综合评价Table 6 Principal component scores and comprehensive evaluation of Cabernet Sauvignon under different night temperature treatments

如表6所示，对综合得分进行排序，得分依次为LT＞CK＞HT，得分越高，果实的品质越好。

3 讨论与结论

3.1 夜间温度对果实品质的影响

本实验分析了夜间温度与葡萄成熟过程中浆果品质指标的关系，认为其与果实干物质代谢和积累有直接的关系。研究发现，成熟期白天温度较高而夜间温度较低，可使葡萄果实着色良好，含糖量等品质都有提高[26]。果实转色后，可滴定酸含量均呈线性下降，高温会加速苹果酸的分解[7]，但LT减缓了酸的降解[16]。这与本实验的结果一致，LT使呼吸消耗减少，碳水化合物相对积累增多；而且苹果酸作为葡萄呼吸作用的主要底物，在浆果成熟过程中被呼吸消耗的速率随温度的升高而增加。研究发现，低温对葡萄浆果汁中的总可溶性固形物的浓度积累没有显著影响[15-16]。本实验发现，在处理期间，HT、LT及CK间果实可溶性固形物有显著差异，这可能与实验设计有关，前人研究采用盆栽葡萄在气候生长室内设置低温胁迫的情况下得出的结论，而本实验是设施调控模拟不同夜间温度的真实环境。本实验还发现，转色期的HT对果实最终可溶性固形物没有影响。

研究发现在低温（白天30 ℃，夜间15 ℃）和高温（昼夜连续30 ℃）条件下，浆果皮中黄酮醇含量无显著差异[15]，而高温会使单宁略有减少[27]。也有研究发现温度对花青素和黄酮醇的浓度影响很大，而对果实单宁的积累无影响[8,28]。本实验中，LT不仅增加了类黄酮的含量，还减缓了单宁和总酚的降解，而HT加速了总酚的降解；果实成熟时，LT单宁和总酚含量均显著高于CK，而HT总酚含量显著低于CK。这是因为夜间高低温改变了气温日较差，加速或减缓植物的呼吸消耗速率，为果实二次代谢物的合成提供了不同含量的必备物质。研究发现夜晚温度较高会抑制成熟早期果实中VvCHS、VvF3H、VvDFR等基因表达，从而导致花色苷合成量减少[13]，而低温会加速花青素的生物合成[29]，且在一定范围内，夜间温度越低，花色苷的积累越明显[9]。这与本实验结果一致，LT处理的果实花色苷浓度显著高于CK，且显著差异从转色期一直维持到收获；HT仅在实验处理期显著低于CK，对果实最终的花色苷含量没有影响。

3.2 夜间温度对果实挥发性香气物质的影响

本实验发现，不同夜间温度明显改变了成熟时赤霞珠果实中香气成分的种类及醛酮类、萜烯类和醇类等化合物在挥发性香气成分中所占的相对比例。葡萄果实中的香气物质主要存在于果皮中，果实的风味物质主要有甜味、酸味和香味[30]，不同果实的香气种类、浓度和质量不一样，构成了葡萄酒不同的风格特征和典型性。Ji等[31]研究发现，冷凉地区葡萄中C6醛含量的积累更高，王秀芹等[32]认为温度虽然有利于酿酒葡萄总糖的积累，但高温不利于香气的形成。本实验结果发现，3 个处理果实中检测到挥发性香气物质共103 种，但共有挥发性物质只有11 种，且较CK而言HT明显减少香气化合物的种类数量，可见不同夜间温度影响了香气物质的合成途径。实验还发现果实中醛类化合物种类和相对含量在总香气化合物中均占有较大的比重，LT和HT均增加了赤霞珠果实中醛类化合物总的相对含量，这可能是温度对果实中的挥发性香气物质的影响有一定的范围，冷凉环境有助于葡萄果实香气物质的积累，但短暂的高温同样会提高葡萄与葡萄酒的品质[33]。虽然挥发性物质中萜烯类和酯类化合物在果实中的占比较小，但其嗅觉感官阈值均很低，二者均会赋予果实品种特殊的香气特征。如带有混合果香和花香的萜烯类β-大马士酮的嗅觉感觉在水中阈值为2～7 ng/L，但对葡萄酒的感官特性影响很大[34]，本实验中LT处理的果实中萜烯类和酯类化合物总的相对含量均明显高于CK。本实验还发现HT和LT处理的果实中醇类化合物的相对含量均较CK减少，且HT处理的果实中没有检测到烷烃类化合物，可见温度对酿酒葡萄果实香气物质的影响是十分复杂的。目前，关于温度影响果实中挥发性香气物质的研究较少，仍需进一步去探讨。

本实验研究结果表明，在果实转色至成熟期，LT增加了可溶性固形物、总糖、花色苷和类黄酮的积累速率，减缓了总酸、单宁、总酚的降解速率，表现为成熟时较CK都有显著提高。HT除显著降低果实总酚以外，对其他品质均没有影响。夜间温度对成熟时果实挥发性香气物质种类和各成分比重有显著影响。与CK相比，HT减少了香气物质的种类数量，但增加了醛类化合物的相对含量；LT提高了醛类、萜烯类和酯类化合物的相对含量；夜间高低温处理均降低了醇类化合物的相对含量。利用PCA综合评价不同处理浆果品质，结果显示综合品质排名依次是LT、CK、HT。因此，LT有助于提升赤霞珠果实品质，HT降低了果实品质。