实时直接分析-四极杆飞行时间质谱法快速鉴别油茶籽油真伪

胡 谦，张九凯，邢冉冉，陈 颖

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.北京工商大学 食品与健康学院，北京 100048)

油茶籽油是油茶树种子经压榨或浸出的世界四大木本植物油之一，油茶树在我国有悠久的栽培和利用历史。油茶籽油的脂肪酸组成比例和理化性质与橄榄油非常相似，而且油酸的含量高于橄榄油，棕榈酸和硬脂酸的含量低于橄榄油[1]，被誉为“东方橄榄油”。油茶籽油易于被人体消化吸收，具有多种生物活性成分，有益于人体健康[2-3]，其价格一般是普通食用油的3～5倍，由于国内油茶籽油市场的消费量日渐增多以及原料产量和成本的限制等原因，受利益驱使的不法厂商往往会向油茶籽油中掺杂廉价食用油以获取暴利。为了打击油茶籽油的掺假使假，维护消费者的合法权益，维护油茶籽油产业的健康发展，为行政执法提供依据，研究油茶籽油的真伪鉴别方法具有重要意义。

目前，油茶籽油的真伪鉴别技术主要有光谱法[4-5]、气相色谱-质谱联用法[6-7]、液相色谱-质谱联用法[8]等。光谱技术具有快速、无损的优点，通常结合化学计量学建立判别模型以鉴别食用油的真伪，但该技术难以筛选食用油的特征标志物。气相色谱以及气相色谱-质谱联用技术检测的化合物多为脂肪酸和甾醇，且需复杂的衍生化步骤，然而食用油主要由甘油三酯(95%～98%)组成[9]，脂肪酸轮廓仅反映了食用油组成的一部分。气相色谱-质谱联用技术虽也被用于分析食用油的挥发性成分，实现对食用油的真伪鉴别[10]，但食用油的加工工艺和产地会对挥发性组分造成非常大的影响[11-12]，因此该方法的可重复性和适用性还需进一步探究。液相色谱-质谱联用技术具有特异性强、灵敏度高的特点，通常用于分析食用油中的甘油三酯、酚类和生育酚等物质，许多研究表明这些化合物可作为食用油真伪鉴别的潜在标志物[13]，但其前处理复杂，分析时间过长，且需消耗大量的有机试剂。

快速发展的敞开式电离质谱技术可在常压敞开环境中直接对样品解吸电离，获得样品组分的轮廓信息[14]，已广泛用于食品品质分析[15-16]、食品真伪鉴别[17-18]、非法添加物检测[19]和司法鉴定[20]等领域。目前已经发展出几十种敞开式电离技术，包括实时直接分析(Direct analysis in real time，DART)、解吸电喷雾电离(Desorption electrospray ionization，DESI)和萃取电喷雾电离(Extractive electrospray ionization，EESI)等[21]。其中DART是一种两步电离技术，在常压条件下利用高压放电将基态的氦气变为激发态，并在陶瓷加热管加热作用下提高动能，将样品组分热脱附，然后通过潘宁电离和气态的质子/电子将样品组分离子化[22]。相比于色谱-质谱联用技术，DART-MS无需或只需极少的样品前处理，即可快速、高通量地分析获得样品的代谢物轮廓信息。另外，相比于基于电喷雾电离的敞开式离子化技术，DART对中低极性化合物具有很强的检测能力。因此，DART非常适用于快速分析主要由低极性甘油三酯组成的食用油。基于此，本研究采用DART-QTOF-MS技术实现了油茶籽油的快速鉴别。首先对食用油处理方法和氦气温度进行优化，以获得更多的代谢物轮廓信息，并解析了油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油的高分辨质谱图中甘油酯离子和源内碎片离子，然后采用化学计量学建立了判别模型，对油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油进行预测。

1 实验部分

1.1 样品、试剂与仪器

20份油茶籽油均由赣州市产品质量监督检验所提供，其中江西省10份，福建省、广东省、广西省和云南省各2份，湖北省和安徽省各1份。菜籽油、花生油和大豆油各8份，由江南大学收集于各油脂加工企业。甲醇和异丙醇购自德国CNW公司，乙酸铵购自美国Sigma-Aldrich公司，均为LC-MS级。DART-QTOF-MS系统由配备12 Dip-It tip模块的DART-SVP离子源(美国IonSense公司)串联TripleTOF 6600质谱(美国SCIEX公司)组成；全石英玻璃棒(北京华质泰科公司)。

1.2 样品处理

称取10 mg(精确至0.1 mg)食用油样品，加10 mL甲醇-异丙醇(体积比50∶50，含5 mmol/L乙酸铵)稀释后，用移液器吸取1 μL滴于全石英玻璃棒上，待有机试剂挥发后进DART-QTOF-MS检测，每份食用油平行3份。

1.3 检测条件

DART离子源参数：DART离子源与Vapur接口的陶瓷管距离为10 mm，Vapur接口的陶瓷管与加热毛细管距离为2 mm;离子化设置为正离子模式，工作气体为氦气，待机气体为氮气;载气温度为450 ℃;12 Dip-It tip模块在氦气下的移动速度为0.6 mm/s;栅极电极为+350 V。

质谱参数：TripleTOF 6600 MS检测离子源接口为NanoSpray离子源；DART-QTOF-MS分析时雾化气和辅助加热气被禁用，气帘气压力10 psi(69 kPa)。TripleTOF 6600 MS采用TOF MS方法和信息依赖分析(Information dependent acquisition，IDA)方法分别获得脂质的MS和MS/MS谱图。全扫描TOF MS中，滞留时间为200 ms，正离子模式，扫描质量范围为m/z100～1 100。MS/MS模式下，碰撞能量(CE)：35 eV；扩展碰撞能量(CES)：15 eV；滞留时间：50 ms；扫描质量范围：m/z50～1 100。数据采集过程中定期采集氦气流下背景空气的质谱信号，用于评估并校正质谱的质量准确度，此方法仅使用了背景离子信号，无需额外内标化合物[23-24]。

1.4 化学计量学分析

使用MarkerView 1.3.1(美国SCIEX)软件提取质谱峰，去除同位素组数据，获得正离子数据矩阵，包括144个样品(48个食用油样品，重复分析3次)中离子的m/z值及其对应丰度。然后将每个食用油样品的3次重复分析的峰强度取平均值，将数据导入SIMCA 15.0(瑞典Umetrics公司)软件进行化学计量学分析，比较不同食用油样本的聚集和离散趋势。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

DART离子源的离子化效率受样品处理方式的影响，因此实验比较了食用油原液和2种稀释处理方式的质谱响应强度和离子丰度，以获得尽可能多的组分信息。考虑到DART离子源具有快速、原位直接电离的优点，首先直接分析了油茶籽油原液的质谱响应强度和离子丰度，结果发现食用油的主要成分甘油三酯的离子化效率普遍较低。如图1A中m/z902.813 0是由三油酸甘油酯(油茶籽油中最主要的甘油三酯)产生，其响应强度明显低于DART源内碎片离子(m/z339.288 7)。因此，直接分析食用油原液的离子化效率不能满足检测需要，难以获得丰富的食用油组分信息。Vaclavik等[25]也发现类似现象，这可能是由于食用油的黏度太高而影响了甘油酯的解吸。

图1 油茶籽油不同处理方式正离子模式的DART-QTOF-MS质谱图Fig.1 DART-QTOF-MS spectra of camellia oil under different pretreated positive ion modes A.edible oil stock;B.methanol-isopropanol(50∶50,by volume) dilution;C.methanol-isopropanol(50∶50,by volume,contain 5 mmol/L ammonium acetate) dilution

由于食用油基质复杂，需适当进行样品前处理以降低基质效应，增强离子化效率，从而获得更多食用油组分轮廓的信息。实验比较了直接分析油茶籽油原液、甲醇-异丙醇(体积比50∶50)稀释和甲醇-异丙醇(体积比50∶50，含5 mmol/L乙酸铵)稀释3种处理方法对结果的影响。结果表明，采用甲醇-异丙醇(体积比50∶50)稀释时甘油酯以[M+NH4]+的形式离子化，与直接分析食用油原液相比，稀释极大地改善了甘油酯的离子化(图1B)。而采用甲醇-异丙醇(体积比50∶50，含5 mmol/L乙酸铵)稀释时，可使甘油酯分子稳定地产生氨加合离子，并显著增强了质谱信号(图1C)。有研究发现[26]，将25%的氨水溶液置于DART离子源附近，可以利用挥发到空气中的氨来增强甘油酯离子化以产生[M+NH4]+。因此，甲醇-异丙醇(50∶50,含5 mmol/L乙酸铵)稀释为最佳食用油前处理方式。

2.2 高分辨质谱分析

采用DART-QTOF-MS技术分析经甲醇-异丙醇(50∶50,含5 mmol/L乙酸铵)稀释的食用油样品，可检出大量甘油三酯(TAG)和甘油二酯(DAG)的氨加合离子[M+NH4]+和质子化离子[M+H]+，且[M+NH4]+的质谱响应更强。此外,TAG还会在DART离子源内裂解产生甘油二酯碎片离子[TAG+H-RCOOH]+、甘油一酯碎片离子[TAG+H-RCOOH-RCO]+和酰基离子[RCO]+等碎片离子。以油茶籽油中最丰富的TAG 54∶3为例，其氨加合产生m/z902.817 1要比质子化产生的m/z885.790 6响应强度高约一个数量级，源内裂解产生的碎片离子依次为m/z603.534 7、339.289 4和265.253 1。这些DART离子源产生的离子及其碎片离子与之前的研究类似[25,27]。表1列出了在4种食用油中均检出的20种TAG和6种DAG，其质量误差均在±5 ppm以内。

表1 4种食用油中以[M+NH4]+鉴定的甘油酯Table 1 Glycerolipids identified by [M+NH4]+ in the four edible oils

在优化的样品处理方式和DART离子源条件下，4种食用油(油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油)的甘油三酯氨加合离子[TAG+NH4]+主要集中在m/z850～1 100范围内，6种DAG加合离子[DAG+NH4]+为m/z600～700，此外还检出部分甘油酯的碎片离子。但由于不同食用油中甘油酯分子的组成和分布不同，4种食用油的DART-QTOF-MS存在明显差异(图2)。油茶籽油中最强离子为TAG 54∶3产生的m/z902.817 5，其次为由TAG 52∶2产生的m/z876.800 5(图2A)。这与前期采用液相色谱-质谱联用技术研究的结果相似，油茶籽油中含量最高的前2种甘油三酯为TAG 54∶3和TAG 52∶2，且TAG 54∶3的相对含量超过30%[28]。菜籽油的最强离子与油茶籽油相同，均为m/z902.817 6，但与油茶籽油不同的是，菜籽油中由TAG 54∶4产生的m/z900.801 2也具有很高的响应(图2B)。Wei等[29]使用液相色谱-质谱联用技术发现，菜籽油中三油酸甘油酯(TAG 54∶3)的相对丰度最高(达25.30%)，其次为二油酸亚油酸甘油酯(TAG 54∶4，相对丰度为21.21%)，与本研究结果相似。在花生油中，由甘油三酯氨加合生成的最强的两个离子与菜籽油相同，但花生油和菜籽油之间整体离子强度存在差异(图2C)。与油茶籽油、菜籽油和花生油均不同的是，大豆油中由甘油酯生成的最强2个离子为m/z896.768 8和m/z898.783 0(图2D)，分别对应TAG 54∶4和TAG 54∶5，这与Wei等[29]的研究结果类似。

图2 甲醇-异丙醇(体积比50∶50，5 mmol/L乙酸铵)稀释4种食用油的DART-QTOF-MS质谱图Fig.2 DART-QTOF-MS spectra of four edible oils diluted with methanol-isopropanol(50∶50,5 mmol/L ammonium acetate)A.camellia oil;B.rapeseed oil;C.peanut oil;D.soybean oil

图3 DART-QTOF-MS分析食用油的PCA得分散点图Fig.3 Score scatter plot of PCA of edible oil analyzed by DART-QTOF-MS

2.3 化学计量学分析

为使DART-QTOF-MS分析获得的4种食用油的多维轮廓信息能实现数据可视化，本研究进一步采用化学计量学分析以解释复杂的数据。采用Markerview软件提取出3 696个离子峰，再经Pareto缩放的无监督主成分分析(Principal component analysis，PCA)方法将数据降维，分析不同组样本的离散和聚集趋势。以20个油茶籽油、8个菜籽油、8个花生油和8个大豆油的数据建立PCA模型，结果发现前5个主成分总贡献为71.3%，其中第一主成分(PC1)贡献为37.0%，第二主成分(PC2)贡献为11.6%。所有样本均在98%的置信区间内，未观察到异常样本。PCA得分图(图3)显示油茶籽油主要集中于第一和第四象限，在第一主成分上可以区分油茶籽油与菜籽油、花生油和大豆油，但菜籽油和花生油在PCA得分图上出现重叠。DART-QTOF-MS质谱也显示，菜籽油和花生油较为类似(图2B、C)，而PCA是一种无监督的模型，可能导致了菜籽油和花生油的重叠。

为减少组内随机误差，突出组间轮廓差异，弥补无监督模型的缺陷，采用有监督的正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)建立判别模型，并对预测集进行预测。4种食用油样本分别随机选取3/4的样本作为训练集以建立判别模型，剩余样本作为预测集以评估判别模型的预测能力。结果显示，OPLS-DA模型的R2X、R2Y和Q2分别为0.754、0.979和0.906，表明模型具有较好的解释和预测能力，且油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油被明显区分(图4A)。为进一步评估OPLS-DA模型准确预测未知样本的能力，将预测集导入OPLS-DA模型。图4B为OPLS-DA模型的预测得分散点图，图中可见每种食用油的预测集(无填充)与相应的训练集(有填充)均准确聚类在一起，说明OPLS-DA模型可准确预测未知样本。但本研究未分析不同掺杂比例的油茶籽油样本，后续研究将扩大代表性的油茶籽油样本，以及其它食用油的种类和数量，以建立更准确、稳定和可靠的食用油种类预测模型和掺杂定量预测模型。

3 结 论

本研究基于DART-QTOF-MS技术开发了一种快速鉴别油茶籽油的方法。在高分辨质谱图中初步鉴定出20种甘油三酯和6种甘油二酯。进一步采用PCA模型观察样本之间的聚集和离散程度，但不能区分油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油。而OPLS-DA模型具有较好的解释和预测能力，可以准确区分并预测油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油。研究表明，该方法无需复杂、耗时的色谱分离，适用于快速鉴别油茶籽油。