常压激光离子源辅助基质的研究进展及其在食品领域的应用

邱 鑫，贺木易，杨敏莉，张 峰

(中国检验检疫科学研究院 食品安全研究所，北京 100176)

近年来，基于激光的敞开式离子源凭借其高效、原位、高空间分辨率和易于成像等优势，被广泛应用于医学检验、食品安全等领域，如常压基质辅助激光解吸电离技术(Atmospheric pressure matrix assisted laser desorption/ionization，AP-MALDI)、电喷雾辅助激光解吸电离技术(Electrospray-assisted laser desorption/ionization，ELDI)[1]、基质辅助激光解吸电喷雾电离技术(Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI)[2]、激光烧蚀电喷雾电离技术(Laser-ablation electrospray ionization，LAESI)[3]、激光辅助解吸电喷雾电离技术(Laser-assisted desorption electrospray ionization，LADESI)[4]、激光解吸电喷雾电离源(Laser-desorption electrospray ionization，LDESI)[5]、激光烧蚀大气压光电离技术(Laser-ablation atmospheric-pressure photoionization，LAAPPI)[6]、激光解吸常压化学电离源(Laser-desorption atmospheric-pressure chemical ionization，LD-APCI)[7]等。基于激光的电离技术虽然极大地促进了质谱分析向实时、原位检测技术的发展，但解离过程中存在分子结构破坏严重、激光能量转化效率低等问题,常需要添加辅助基质以提高对激光能量的吸收，改善特定波长激光的能量转化效率。

AP-MALDI是一种在大气压条件下工作的软电离技术，也是最常用的敞开式激光电离源，对于较难离子化的大分子物质(102～106Da)，特别是蛋白质类的生物大分子[8-10]，具有一定的离子化效果。AP-MALDI技术具有分析速度快、灵敏度高、实时原位检测等特点，与另一种软电离方法电喷雾离子源(ESI)相比，AP-MALDI对样品的前处理要求更宽松，且更易得到单电荷离子峰。基于以上优点，AP-MALDI在医学、药学、食品等行业得到了广泛应用[11]。最近的研究表明，AP-MALDI可与便携质谱(Portable mass spectrometry)相结合，极大地提高现场分析能力[12]。

AP-MALDI的工作原理是使用激光照射待测物质与基质形成的共结晶薄膜时，基质从激光中吸收能量传递给待测分子，而电离过程中涉及到待测物质电荷转移和由固态至气态的相转变过程，最后待测物以气态离子的形式进入质量分析器[13](见图1)。此外，基质的加入还可起到分散分析物的作用，防止分析物之间发生相互作用或产生类似于二聚体的信号。在此过程中，基质及其添加剂的性质(如酸碱度、分子量，是否具有发色团)、基质的使用方法等会直接影响共结晶的厚度和均匀程度，进而对电离的整体效果和分析结果的准确性、灵敏性和重复性造成巨大影响[8]。因此，选择合适的基质或基质添加剂对于AP-MADLI的电离效果至关重要。

图1 基质辅助激光解吸电离的离子源原理及新型基质研发策略[13]Fig.1 Mechanism of matrix assisted laser desorption/ionization and development strategy of new matrix[13]

1 AP-MALDI辅助基质的研究进展

根据基质的作用和既往研究，总结出辅助基质的几个基本特点。首先，基质和待测样品应具有较好的互溶性，或可溶于同一类溶剂中，使得基质材料存在于溶剂蒸发后与分析物形成的共结晶中，此时可认为基质材料是待测物的固体溶剂。其次，基质必须具有较强的特征波长吸收性质[14]。AP-MALDI中的待测物需要由基质进行激光能量的吸收和转移来实现软电离，以避免样品分子在激光中不必要的断裂。除此之外，合格的基质还应具有反应惰性，既不与待测物质发生反应改变其结构和含量，又需有一定的吸附和解吸附能力。值得注意的是，挥发性的基质一般需提前进行排除，以减少基质对检测结果的干扰。除了考虑以上特性外，基质的选择还需要结合待测物的分子质量范围和理化性质进行评估。然而，现有基质常具有局限性，例如基质与样品分子共结晶不均匀，基质与样品间能量转移效果差，基质自身的电离峰干扰样品检测[15]，这些问题阻碍着AP-MALDI的进一步应用。开发稳定不易电离，能够与样品形成均匀而分散良好的共结晶的基质是推动AP-MALDI进展的首要任务。

1.1 传统基质概述

自激光离子源(LDI)问世以来，最重要的突破莫过于使用基质作为化学反应的媒介。传统的基质几乎均为有机基质，具有芳香环结构，在245～355 nm波长范围内具有明显的紫外吸收，且分子量主要集中于200 Da左右，例如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、4-羟基-3，5-二甲氧基肉桂酸(SA)、9-氨基吖啶(9-AA)、2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB)等。在这类基质中，可离子化的羧基、羟基是检测多肽、蛋白质等极性物质的基质中常见的官能团，均能表现出一定的质子亲和力，可与分析物之间形成质子交换。然而，传统基质在检测样品时易出现部分区域内的信号强度明显增大(称之为“热点”)，而其他区域信号强度降低的现象[16]。“热点”出现的不均匀性、随机性和难避免性导致每次检测的信号强度会出现明显差异，这对样品的检测重现性有着不利影响。此外，基质自身电离产生的碎片离子峰会掩盖、抑制或增强样品的峰信号，干扰后续的质谱分析。为此，对现有基质进行加工修饰或开发新基质等改善措施是刻不容缓的。

1.2 有机基质的研究进展

目前有机基质的使用最为广泛，且适合多种目标物的分析，其中，尼克酸是最早应用于MALDI中的有机基质。随着人们对有机基质不断深入的研究和发展，更多的有机基质因其在MALDI中良好的适用性而被发掘，如CHCA、9-AA、DHB等。虽然这些有机小分子在基质辅助激光离子源中具有一定的通用性和稳定性，但随着检测目标的扩大和检测要求的增加，传统基质的局限性限制了其进一步应用。最初，由于小分子物质的化学可塑性，人们着力于传统基质的优化，这在一定程度上提高了对某些特定对象的分析表现，但其局限性未得到有效改善。而对传统基质进行修饰，或采用添加剂、混合基质等方法，是目前比较主流的改善基质辅助激光离子化效率的方法。

1.2.1 针对传统基质的修饰Fukuyama团队[17]通过对传统DHB基质进行长链烷基化修饰，得到新基质烷基化二羟基苯甲酸(ADHB)。由于疏水烷基链的引入，基质和疏水性多肽的结合能力大大增强，从而改善了该疏水性物质的检测效果。将ADHB与传统基质CHCA进行比较，发现ADHB对疏水性肽链的结合效果显著增强，检测灵敏度提高了10～100倍，但“热点”不均匀现象并未得到很好地改善，且ADHB因单独作为基质缺乏离子化能力而只能被用作添加剂。该团队进行了进一步探索：引入烷烃链对传统基质THAP进行功能化修饰，产生新基质烷基化三羟基苯乙酮(ATHAP)。与传统基质CHCA相比，该新基质规避了“热点”的产生，检出限降低了1个数量级。除了功能化修饰外，新原子的引入对于基质的质子亲和力也具有很大影响。Jaskolla团队[18]以CHCA的结构为基础引入了氯，产生的新基质Cl-CHCA相对于传统CHCA表现出更强的多肽亲和力以及检测灵敏度，同时重现性也得到改善。膜蛋白对于生物系统至关重要，但其特殊的性质使分析和检测成为难题，尤其是疏水性膜蛋白。Wang等[19]对CHCA的羧基烷基链进行酯化修饰，并合成了一系列衍生物，其中CHCA-C3对完整蛋白分子表现出极高的检测灵敏度。这主要归功于该新基质的高激光消融能力以及分子间疏水亲和力的提升。总体来说，针对某种特定目的进行传统基质的修饰是一种简单、可行、有效的方法。

1.2.2 基于传统基质的混合基质以传统基质的理化性质为基础，结合不同添加剂或不同性质的基质进行总体基质的改变，是近年来研究人员探索的一种较简易的方法。Abdelhamid等[20]将糠酸和甲芬那酸混合生成新基质，用于检测谷胱甘肽、三磷酸腺苷、磺胺噻唑等混合物。新基质可有效吸收激光能量并进行能量转移，减少了离子碎片峰的数量，并显著提高离子化效率。将新基质与传统基质DHB进行对比发现，新基质在真空条件下呈现出更高的稳定性，推测是由于混合基质中的甲芬那酸具有高于DHB基质1.2倍的升华能力。Lu等[21]以喹诺酮类物质为基质添加剂，检测血液中的痕量喹那普利。研究发现含氮化合物可以抑制血液中共存物对喹那普利分析的干扰，而传统基质CHCA即使经过优化、修饰也不能很好解决这一难题。同时比较了氧氟沙星、双氟沙星等喹诺酮类物质作为基质添加剂的效果，证实使用该类物质作为基质添加剂对血液中痕量喹那普利的识别和定量具有很好的效果。

1.2.3 离子液体基质由于传统基质中“热点”不均匀问题的不可避免，在AP-MALDI检测过程中信号处理往往需通过平均化全部光斑区域的光谱能量以获得更可靠的结果，但经过平均化的结果准确性和重复性较差，参考意义低，不能用于量化。因此，相关解决方法必须从基质与分析物共结晶的均匀性入手，例如通过快速蒸发基质溶液或添加改性剂，但这些改进往往需要复杂操作或额外设备，难以实现现场分析效果的改善。近年来，液体基质的应用极大改善了辅助基质中共结晶不均匀问题，尤其是离子液体，受到越来越多研究者的青睐。离子液体是指在室温下呈液态，熔点低于100 ℃的盐，于2001年首次出现在辅助基质的报道中[22]，但当时所用的室温离子液体因不具有显著的紫外吸收性质而未得到重视。随着科技进步，研究人员在此基础上进行了改进，通过等摩尔混合经典的酸性辅助基质(CHCA、DHB、SA)与不同的有机碱(吡啶、三丁胺、1-甲基咪唑)产生新的液体基质。这些新基质显示出很好的兼容性与分析性能，很大程度上改善了固体基质的“热点”问题。Shrivas团队[23]将CHCA-丁胺与DHB-丁胺进行等摩尔混合得到新的离子液体基质，用于鉴别小鼠肝细胞和脑切片中的磷脂及其分布。采用质谱成像技术对新基质和普通基质进行对比，结果证明离子液体基质可有效改善共结晶不均匀问题，并且高重复性证实了此方法的有效性和可靠性。由于寡糖与传统基质中碎片离子的分子量较为接近，使用AP-MALDI区分和检测寡糖较为困难。Pei等[24]分别考察了4种生物碱与DHB合成的离子液体基质，选择2，5-二羟基苯甲酸丁胺(DHB-BuN)作为基质用于分析寡糖样品，并证实该方法具有较好的灵敏度和重复性。在此基础上，对大豆和大豆叶直接切片后进行基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)成像分析，省去了繁琐的前处理过程，且使用该基质质谱检测背景干扰低，寡糖的分布清晰，重复性好。Ling等[25]开发了一种由四甲基胍和THAP以3∶1混合而成的离子液体基质，优化后的基质表现出很好的重现性和耐盐性，可在负离子模式下有效降低磷酸化肽的碎裂，选择性地提升磷酸化肽的检出率。这进一步说明离子液体基质在基质辅助激光离子源中具有很大的应用潜力。

1.2.4 新型有机基质尽管采用不同的添加剂或修饰方法可在很大程度上对现有基质进行改造，但开发新的有机化合物作为基质仍是该领域的热门方向，尤其是针对一些缺少质子化基团、稳定性差、极性大的目标物，因为这类目标物的质谱分析往往需要冗长繁琐的前处理程序。盐类物质在近年也被用作新基质。Chen等[26]发现含氮物质在负离子模式下的检测性能更好，选择N-(1-萘基)-乙二胺作为新辅助基质在负离子模式下分析小分子化合物，结果表明与传统基质CHCA和DHB相比，新基质的碎片离子峰更少，灵敏度更高。Wang等[27]使用香豆素类化合物作为基质用于疏水性化合物的分析，并比较了5种常见香豆素以及传统基质CHCA和DHB在MALDI中的分析性能，其中6，7-二羟基香豆素-3-羧酸对于疏水性化合物表现出更好的检测灵敏度、稳定性以及重现性。由于糖苷键的不稳定性，相应的分析检测方法往往使用碱金属添加剂来保持其结构稳定。此外，一些生物特异性的识别分子也被用于基质修饰，以提高方法选择性，如核酸适配体修饰、分子印迹修饰等。

1.3 无机基质的研究进展

为扩展基质辅助激光离子源在分析领域的应用，研究者在基质开发方面开展了大量工作。随着有机基质的不断进展，基质在激光照射中产生的干扰碎片逐渐减少，对分析检测结果的影响也逐渐降低。然而，更低基质干扰和更干净基质峰的实现却稍显困难。与有机基质不同，以碳材料和多孔材料为代表的多数无机基质在AP-MALDI条件下自身不易发生电离或信号低，不会形成较强的碎片离子峰，且更大的比表面积和多孔结构使样品分子分散更均匀[28]。与传统基质相比，无机基质的背景信号峰普遍更低，基本不会对分析物的检测造成干扰。因此，对无机基质材料的探索逐渐兴起。

图2 可用于辅助基质的碳基材料及其常见修饰策略[30]Fig.2 Carbonaceous materials for auxiliary substrates and their modification strategies[30]

1.3.1 碳基纳米材料在所有无机材料中，碳材料(包括石墨、石墨烯、碳纳米管等)因具有良好的光吸收性和电荷转移能力，不易发生电离和碎裂，且具有高度生物相容性而吸引了大量研究人员的关注[29]。碳材料的引入最早起源于石墨在MALDI中的应用，但这种三维层片状结构并不能很好地分散于溶剂中。条状碳纳米管是二维结构，由于体积的缩小，该材料在溶液中的分散性得到了很大改善，但其与靶板的亲和力较小，易在激光照射时脱离靶板而污染离子源。为改善新材料对靶板的吸附效果和在溶液中的分散性，对碳材料进行修饰成为研究者的首选[30](见图2)。

2010年，石墨烯首次被报道作为新基质使用，其片层结构和较大的比表面积被认为是成功应用于AP-MALDI的显著优势，且克服了小分子范围内碎片干扰峰频出的问题，对多种化合物(如聚胺、核苷、氨基酸等小分子)表现出很好的检测性能。因此，对石墨烯及以石墨烯为基础的改性或功能化材料的研究和探索也显著增加。Gulbakan等[31]将氧化石墨烯和适配体结合生成适配体功能化氧化石墨烯，这种新材料对血液中的可卡因和腺苷表现出很好的富集作用。Min等[32]考虑到杂原子与石墨烯结合可以形成稳定的π键，既可吸收足够的能量又具有捕获质子的潜力，使用热退火合成方法，以气态三聚氰胺作为氮源合成氮掺杂石墨烯。合成的新基质在正离子模式下产生大量且复杂的加成物离子峰，但在负离子模式下仅产生相应的分子离子峰，且无背景离子峰。

石墨烯具有特殊的电子和自组装特性，这为新材料的发展提供了更多机会。而六隅体的结构具有极高稳定性和低化学反应活性，尤其是盘状多环芳烃类高纯度有机材料。其中，典型的盘状多环芳烃为苯并菲以及六环六苯并蔻(HBC)衍生物。在2014年对HBC的合成和使用进行了突破后，Wei课题组[33]首次使用该类材料作为辅助基质检测3种磺胺类抗菌药，并与CHCA等3种传统基质和常规石墨烯进行了比较，结果说明该课题组合成的新基质对于磺胺混合物具有很好的信噪比和区分能力，同时背景离子峰少，具有更好的检测灵敏度。

碳点是迄今为止发现并投入使用的最小碳纳米材料，尺寸一般在10 nm以下。与其他碳材料相似，碳点在低分子量处难电离，仅会出现比较集中且易于区分的碳簇峰，m/z超过120以后则无背景峰，这是有机基质所无法比拟的优势。不同于普通碳材料，碳量子点表面含有丰富的亲水基团(如羟基、羧基)，在溶液中具有良好的分散性，因此具有作为辅助基质的巨大潜力。2013年，氮掺杂碳量子点首次被用作基质并取得了瞩目的成果，自此，开发新的碳量子点基质成为分析行业内的潮流。Wang等[34]通过水热法制备氮和硫共掺杂碳量子点，并对其作为基质的性能进行了鉴定和比较，结果证明该方法无基质相关峰的干扰，且对于多种小分子具有较强的适用性。

1.3.2 磁性功能材料磁性材料的优势是使样品具有在外磁场作用下易于分离的性能。在实际检测中，磁性材料的添加可以简化前处理步骤，节省检测时间和劳动力消耗。分析流程如图3所示。常用的磁性材料包括铁、钴、镍及其氧化物(如四氧化三铁、三氧化二铁)、合金材料及其混合物等。目前应用最广的磁性材料为四氧化三铁，其纳米颗粒具有磁性强、尺寸小、比表面积大和生物兼容性良好的优点，常被制作成纳米微球磁性复合材料。功能化修饰是对磁性功能材料进行加工的基本方法之一，Liu等[35]对四氧化三铁纳米氧化石墨烯材料进行聚丙烯酸功能化修饰，发现其对正离子有机物具有明显的吸附和分离效果。将磁性颗粒包裹于碳材料的表面制备磁性复合材料则是另一个主流方向。使用这种方法合成的磁性石墨烯/碳纳米管复合材料，不仅具有很强的磁性，还有效避免了碳纳米管和石墨烯的团聚。

图3 磁性辅助基质用于激光离子源的样品预处理及其分析流程Fig.3 Sample pretreatment and analysis process of magnetic matrix applied to laser based ionization source

Wei课题组[33]使用Hummers法合成了氧化石墨，随后对其进行超声剥离得到氧化石墨烯，再利用氧化还原反应合成了磁性氧化石墨烯，最后在其表面覆盖1层二氧化硅。该方法不仅解决了磁性材料脱落问题，还保持了材料的磁性以供多次重复使用。该团队将合成的新材料作为基质直接用于喹诺酮类药物的快速检测，前处理和样品富集耗时大大缩短。与CHCA相比，新基质不仅背景干扰小，而且具有极高的灵敏度和信噪比。

1.3.3 其他无机材料在辅助基质中，硅材料(如二氧化硅)和金属材料(如金纳米颗粒)等占据重要的位置。Abdelhamid等[30]首次提出了用介孔二氧化硅(G@SiO2)包覆石墨烯作为辅助基质，石墨烯通过表面活性剂作用于SiO2，表面活性剂作为引发剂引起进一步电离。与传统基质不同，该G@SiO2成功产生了多电荷多糖，为多电荷电离方法的进展提供了参考。沸石是一种典型的具有介孔结构的硅铝酸盐材料，作为典型的骨架型硅酸盐，其结构包括硅(铝)氧四面体-环-笼-分子筛，被广泛用作工业催化剂与吸附剂。因沸石本身不具有共轭结构，因此大多作为添加剂或修饰材料使用，但其表面的阳离子交换功能可使其呈现出不同的酸度，因此可作为质子供体或质子宿主，用以提高分析物的峰响应。Suzuki等[36]使用锂修饰沸石结合THAP形成新基质，该基质能够对传统MALDI难以检测的低分子量物质进行检测，且对乙酰水杨酸和苯巴比妥也表现出较好的检测能力。

2 AP-MALDI在食品领域的应用

食品含有多种营养成分，如碳水化合物、蛋白质、肽、脂类、氨基酸和有机酸。除营养成分外，食品还可能含有害物质，如农兽药残留、真菌毒素、有害食品添加剂和致癌物质等。因此，从食品安全角度来看，分析和检验食品的组成成分至关重要，而这些成分因理化性质不同需要不同的分析检测手段进行定性定量。气相色谱-质谱联用(GC-MS)和高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)是分析食品成分的常用方法。其中，针对挥发性有机化合物的鉴定和分析多采用GC-MS法，如多元醇和维生素等，或使用衍生化试剂对非挥发性化合物进行处理后检测。HPLC-MS法利用被分析组分的极性差异进行分离后再进行质谱鉴定，可用于分析多种不同性质的化合物[37]。虽然这些方法具有通用性，但往往面临冗长而繁琐的前处理过程，且对于特殊性质的物质，传统方法难以满足检测需求。除了定量研究，空间分布检测在食品加工、真假鉴别和食品安全中也发挥着重要作用，而这一检测目标需要更特别、有效的分析方法。

基于AP-MALDI的质谱成像是一种先进的二维分析方法，既无需对组织切片进行复杂的提取、纯化、分离，也无需对分析物进行标记，是一种方便有效的检测手段。表1归纳了近几年AP-MALDI相关分析方法在食品分析领域的应用。Nakabayashi等[38]将制备的切片直接转移到具有ITO涂层的玻璃玻片上，随后进行质谱成像分析，显著改善了植物组织样品制备阶段水分的控制。Enomoto等[39]使用传统DHB基质对猪肉中的酰基化合物和胆碱类化合物进行成像分析，并以此作为食品质量评价的标准。De Oliveira等[40]基于MALDI结合质谱成像针对巧克力中的可可开发了一种半定量技术，不仅可以有效检测其分布，还能为健康食用巧克力提供参考。新基质也被应用于食品的质谱成像分析。Wisman等[41]采用盐类作为基质对水稻中的米曲霉菌丝进行检测，优化选择N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(NEDC)作为基质，以期能够通过此方法提高食品安全性。纳米材料的发展极大地改善了营养物质的分析表现。Nizio等[42]开发了一种109Ag纳米粒子增强靶板(109AgNPET)用于对草莓中的多类小分子有机物进行检测，使小分子化合物的检出限明显降低。张峰团队[43]通过质谱成像技术分析了土豆芽中生物碱的空间分布情况，并建立了时间变化规律模型，这对于食品安全风险捕捉与规律挖掘具有重要意义。常压基质辅助激光原位质谱成像技术是可视化食品分子组成的一种有价值的工具，不仅可以识别食品的营养成分含量，还可通过组分的分布特点提高食品安全性，对于机理研究、原位分析、现场检测等具有实际价值。

表1 常压基质辅助激光离子化质谱在食品分析及食品安全中的应用Table 1 Application of food analysis and food safety using atmospheric pressure matrix assisted laser ionization source mass spectrometry

(续表1)

3 结论与展望

常压基质辅助激光技术的出现改善了LDI中难挥发和热不稳定的高分子量样品的离子化问题，并在一定程度上扩展了可检测范围，为分析应用提供了新的方向。经过近几十年的发展，形成了几个较通用的传统基质如CHCA、DHB、THAP等，这些基质虽然检测大分子物质的效果良好，但对于低分子量化合物，由于自身电离产生的干扰峰以及“热点”现象等局限，限制了其进一步的应用，也推进了不同的基质及基质添加剂的进展。从最基础的传统基质修饰，到液体基质、无机基质的引入，AP-MALDI的应用范围不断加大。纳米材料、磁性材料、碳材料以及硅材料的结合及其不断创新，使基质背景峰干扰越来越少，甚至达到几乎无背景干扰。伴随着灵敏度和信噪比的不断提升，前处理步骤也逐渐减少，使得AP-MALDI方法更易与便携设备结合，实现现场快速分析。新基质材料的引入不仅使离子化效果得到改善，还减少了分析方法对硬件设备性能的依赖，大大降低了分析成本。另一方面，扩展的化合物种类(尤其是各类小分子物质)也拓展了其应用范围，通过多学科融合，推进了特定应用领域(如食品分析领域)研究的广度与深度，也促进了新型便携设备、新型离子源、新原理分析方法的研发。从本文可以看出，快速现场分析今后的发展方向是提高检测灵敏度和分析选择性、简化流程以及降低成本。辅助基质的创新工作，必将大大促进基于激光离子化质谱技术的广泛应用。辅助基质的发展趋势不再局限于简单的化学改性，多类材料及纳米材料的联合应用将是未来的主要发展趋势。