miR-196a通过靶向NR6A1降低宫颈癌Hela细胞生存和运动能力

梁 燕，朱万娇，张志苏，许 红，张 健

(1.襄阳市中心医院/湖北文理学院附属医院妇科，湖北 襄阳 441021;2.荆州职业技术学院附属医院妇科，湖北 荆州 434020)

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，也是导致发展中国家女性死亡的主要原因[1-2]。据统计，全球宫颈癌患者超过50万，其中80%的患者来自发展中国家[3-4]。手术和放化疗仍是治疗宫颈癌的主要方法，但二者均不能有效降低宫颈癌的致死率。因此，探究宫颈癌的发生发展机制、寻找根治宫颈癌的方法是目前的研究热点。有研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)在癌症中的异常表达及其对下游靶蛋白表达的调控在癌症的发生发展过程中发挥了重要作用，既可诱导癌症的发生发展又能抑制癌症的恶化[5]。miR-196a是一类具有抑癌和诱导癌症发生发展双向作用的miRNA。研究显示，miR-196a在乳腺癌细胞中呈低表达状态，上调miR-196a表达能显著抑制癌细胞的侵袭和迁移[6]。而miR-196a在宫颈癌细胞中呈高表达状态，下调miR-196a表达可抑制宫颈癌细胞增殖[7]。NR6A1是一类生殖细胞核因子，在胚胎发育过程中具有重要作用[8]。有研究表明，NR6A1在肿瘤细胞中呈高表达状态，可能与癌症的发生发展密切相关，并且生物信息预测表明NR6A1可能是miR-196a的下游靶标[9]。但miR-196a能否通过调控NR6A1的表达影响宫颈癌的发生发展还未见报道。因此，本研究以宫颈癌Hela细胞为研究对象，探究miR-196a与NR6A1的靶向关系及其对宫颈癌Hela细胞生存和运动能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

细胞培养液RPMI 1640和胎牛血清购自美国Gibco公司。反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、荧光素酶报告试剂盒和Lipofectamine 2000TM均购自美国Invitrogen公司。TRIzol试剂盒、BCA试剂盒和RIPA裂解液购自北京索莱宝生物科技公司。CCK8试剂盒和Annexin V-FITC购自美国ThermoFisher生物公司。GAPDH、NR6A1、Ki-67、MMP-9、Caspase-3和VEGF一抗购自美国CST公司，二抗购自美国Santa Cruz公司。miR-NC、miR-196a inhibitor、mimic-NC、miR-196a mimic和pcDNA- NR6A1均由美国Invitrogen公司设计合成。

1.2 细胞来源及培养

正常宫颈上皮HcerEpic细胞和宫颈癌Hela细胞、CaSki细胞由中国科学院上海细胞库提供。将上述细胞接种于培养瓶或培养板中，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液，2～3 d传代1次，细胞传代密度为1×104/mL，取第3～5代细胞进行实验。

1.3 RT-PCR检测miR-196a和NR6A1 mRNA表达

用TRIzol试剂盒提取正常宫颈上皮HcerEpic细胞和宫颈癌Hela细胞、CaSki细胞的总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，并用PCR仪进行扩增。根据荧光定量试剂盒说明书对cDNA进行定量分析，miR-196a以U6为内参，NR6A1以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算miR-196a和NR6A1相对表达水平。反应程序:95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。实验所用引物均采用Primer 5进行设计，由上海生工合成。NR6A1正向引物5’-GGGATGAACCGGAAGGCTATC-3’，NR6A1反向引物5’-GGCTGGTTGCTCTCCGAAG-3’；miR-196a正向引物5’-CCGACGTAGGTAGTTTCATGTT-3’，miR-196a反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACAR-3’；U6反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，GAPDH反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCA-3’。

1.4 细胞转染

根据说明书用Lipofectamine 2000TM将miR-NC、miR-196a inhibitor、阴性对照质粒pcDNA、过表达质粒pcDNA-NR6A1、inhibitor +NR6A1转染到Hela细胞中，分别命名为NC组、miR-196a inhibitor组、pcDNA组、pcDNA-NR6A1组、inhibitor+NR6A1组。Control组则仅加入Lipofectamine 2000TM。转染6 h后将转染液更换为正常细胞培养液进行培养，24 h后进行相应检测。

1.5 荧光素酶报告实验

利用生物信息预测网站预测NR6A1 3’UTR序列上miR-196a的结合位点，用PCR将结合片段进行扩增并插入到荧光素酶载体中，构建NR6A1野生质粒(NR6A1+wt)。随后利用基因突变技术将NR6A1 3’UTR与miR-196a的结合位点突变并克隆到载体中，构建NR6A1突变质粒(NR6A1+mut)。用miR-196a mimic或其阴性对照mimic-NC联合NR6A1野生质粒或突变质粒转染Hela细胞，根据荧光素酶基因报告试剂盒说明书检测各组细胞荧光素酶活性。

1.6 CCK8检测细胞活性

将传代至第3～5代的Hela细胞接种于96孔板内，并按照1.4项下方法转染，各组连续培养1 d、2 d、3 d、4 d，每孔加入10L的CCK8试剂，于培养箱继续培养24 h后用酶标仪检测各组细胞吸光度，计算细胞增殖倍数。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

转染后约48 h收集各组细胞，PBS洗涤细胞，并用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色，4 ℃避光孵育10 min,随后上机检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.8 Transwell检测细胞侵袭能力

将按照1.4项下方法转染后的各组细胞接种到用基质胶包被的Transwell小室上层中，密度为1×106/mL，用无血清培养液进行培养，小室下层则加入正常培养液进行培养。连续培养24 h后用无菌棉签擦去上层未穿膜细胞，0.5%结晶紫对下层迁移细胞进行染色，并进行计数统计。

1.9 划痕实验检测细胞迁移能力

实验前1 d用记号笔于12孔板背面划平行直线，至少有3条直线穿过每个培养孔。第2天将Hela细胞以5×104/mL的密度接种于12孔板内，并按照1.4项下方法转染细胞，6 h后用10L枪头垂直于培养板正面直线划痕，并用PBS洗涤，0.5%结晶紫悬浮细胞，加入无血清培养液继续培养24 h，显微镜下观察细胞迁移情况，并计算细胞迁移率。

1.10 免疫印迹检测NR6A1蛋白表达

按照1.4项下方法处理细胞48 h后，收集细胞,用RIPA裂解液提取各组细胞蛋白，用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。将蛋白浓度调平后用10% SDS-PAGE分离蛋白并转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗GAPDH(1∶1 000)、NR6A1(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)和VEGF(1∶1 000)于4 ℃封闭过夜。第2天用TBST洗去未结合一抗，加入山羊抗兔二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，加入化学发光显色液于暗室曝光显影。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 宫颈癌细胞中miR-196a和NR6A1 mRNA的表达

RT-PCR实验结果表明，宫颈癌Hela细胞和CaSki细胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表达量均明显高于正常宫颈上皮HcerEpic细胞(P<0.01)，且以Hela细胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表达量最高(P<0.05)，见图1。因此，选择Hela细胞进行后续实验。

*：与HcerEpic组比较，P<0.01；#：与CaSki组比较，P<0.05图1 miR-196a和NR6A1 mRNA在HcerEpic、Hela和CaSki细胞中的表达

2.2 miR-196a与NR6A1的靶向关系

与Control组比较，NC组Hela细胞NR6A1蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)，miR-196a inhibitor组NR6A1蛋白表达水平明显较低(P<0.01)，提示miR-196a能调控NR6A1表达(图2)。生物信息预测结果表明，NR6A1基因序列上有miR-196a的靶向结合位点；此外，荧光素酶报告实验结果表明，miR-196a inhibitor能显著降低NR6A1野生质粒的荧光素酶活性(P<0.01)，但对NR6A1突变质粒的荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)，提示miR-196a可靶向调控NR6A1表达(图3)。

*：与Control组比较，P<0.01

*：与NR6A1 wt+miR-NC组比较，P<0.01

2.3 下调miR-196a表达对宫颈癌细胞增殖的影响

pcDNA-NR6A1能显著提高Hela细胞中NR6A1蛋白表达水平(P<0.01)，见图4，表明转染成功；转染细胞4 d后，与Control组比较，miR-196a inhibitor组细胞增殖倍数明显较低(P<0.01)，pcDNA-NR6A1组细胞增殖倍数显著较高(P<0.01)；与miR-196a inhibitor组比较，inhibitor+NR6A1组细胞增殖倍数显著较高(P<0.01)，见图5，表明miR-196a inhibitor能通过下调NR6A1表达抑制Hela细胞增殖。

*：与Control组比较，P<0.01

*：与Control组比较，P<0.01；#：与miR-196a inhibitor组比较，P<0.01图5 miR-196a对Hela细胞增殖的影响

2.4 下调miR-196a表达对细胞凋亡的影响

流式细胞术实验结果表明，miR-196a inhibitor能显著提高Hela细胞凋亡率，pcDNA-NR6A1能显著降低Hela细胞凋亡率，与Control组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-196a inhibitor组比较，inhibitor+NR6A1组细胞凋亡率明显较低(P<0.01)，见图6。免疫印迹实验结果显示，miR-196 inhibitor组Caspase-3表达较高，pcDNA-NR6A1组Caspase-3表达较低，与Control组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图7。

*：与Control组比较，P<0.05；#：与Control组比较，P<0.01；△：与miR-196a inhibitor组比较P<0.01

*：与Control组比较，P<0.05；#：与Control组比较，P<0.01；△：与miR-196a inhibitor组比较，P<0.01

2.5 下调miR-196a表达对宫颈癌细胞侵袭及迁移能力的影响

与Control组比较，miR-196a inhibitor组侵袭细胞数明显较少(P<0.01)，pcDNA-NR6A1组侵袭细胞数明显较多(P<0.01)；与miR-196a inhibitor组比较，inhibitor+NR6A1组侵袭细胞数明显较多(P<0.01)，见图8。同时，miR-196a inhibitor组细胞划痕闭合率显著低于Control组(P<0.01)，pcDNA-NR6A1组细胞划痕闭合率显著高于Control组(P<0.05)；inhibitor+NR6A1组细胞划痕闭合率显著高于miR-196a inhibitor组(P<0.01)，见图9。此外，miR-196a inhibitor还能显著抑制Hela细胞中Ki-67、VEGF和MMP-9的表达(P<0.01)，pcDNA-NR6A1显著促进Ki-67、VEGF和MMP-9的表达(P<0.05)，inhibitor+NR6A1能显著减弱miR-196a inhibitor对Hela细胞中Ki-67、VEGF和MMP-9表达的抑制作用(P<0.01)，表明miR-196a可通过靶向上调NR6A1表达促进Hela细胞侵袭和迁移，见图7。

*：与Control组比较，P<0.01；#：与miR-196a inhibitor组比较，P<0.01

*：与Control组比较，P<0.05；#：与Control组比较，P<0.01；△：与miR-196a inhibitor组比较，P<0.01

3 讨论

miR-196a是一类位于脊椎动物HOX基因簇区域的miRNA，主要调控胚胎发育过程中同源转录因子的编码，从而调控基因的遗传表达[7,10]。近年来研究表明，miR-196a参与癌症的发生发展。miR-196a在胃癌、胰腺癌及口腔癌细胞及组织中均呈高表达状态，提示miR-196a可能具有致癌作用[11-13]。本研究发现，miR-196a在宫颈癌Hela细胞中的表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞，表明miR-196a可作为宫颈癌发生及恶化的指标。研究表明，miR-196a通过靶向LRIG3来促进子宫颈癌细胞的增殖和迁移[14]。本研究发现，miR-196a inhibitor能显著降低宫颈癌Hela细胞的增殖倍数及细胞增殖蛋白Ki-67的表达，还能显著增加癌细胞凋亡率，提高凋亡相关蛋白Caspase-3的表达，并抑制癌细胞侵袭和迁移，进一步表明miR-196a在宫颈癌中发挥着致癌作用，但其具体的作用机制有待进一步探讨。

一项研究表明，miRNAs主要通过与靶向蛋白基因3’-UTR段结合调控靶向基因转录[15]。因此，探讨miR-196a的靶向基因是了解miR-196a在宫颈癌中致癌作用机制的关键。在上皮性卵巢癌中，miR-196a可通过靶向下调HOXA10的表达促进卵巢癌SKOV3细胞侵袭和迁移[16]；在头颈部鳞状细胞癌中，miR-196a可通过下调IκBα表达促进胶质母细胞瘤的癌细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导癌细胞上皮间质转化的发生及放疗抵抗的形成[17]；Feng等[18]的研究表明，miR-196a可通过靶向SFRP1促进胃癌细胞侵袭和转移；Villegas-Ruiz等[19]的研究表明，miR-196a还可通过抑制HOXC8影响宫颈癌细胞的增殖。每一个miRNA均有成百上千个靶向蛋白，miRNAs的功能及靶向蛋白还与特定的病理生理情况有关[20]。因此，进一步探讨miR-196a对宫颈癌细胞生存及运动过程相关靶向蛋白的影响，有利于了解宫颈癌的发病机制。

生殖细胞核受体NR6A1是一类转录抑制因子，在小鼠胚胎发育、神经再生和配子形成过程中发挥着重要作用[21]，并且在前列腺癌及膀胱癌中均呈高表达状态[22]。本研究发现，NR6A1在宫颈癌Hela细胞中表达水平明显升高，其可能参与了宫颈上皮细胞的异常分化，与宫颈癌的发生发展有关。进一步研究发现，NR6A1高表达能促进宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移，并抑制癌细胞凋亡。本研究发现，抑制miR-196a表达能下调Hela细胞中NR6A1的表达水平，上调miR-196a表达能显著诱导NR6A1表达，提示miR-196a可能靶向调控NR6A1表达。通过生物信息预测发现，NR6A1基因序列上有连续的miR-196a结合位点，荧光素酶报告实验也进一步证明miR-196a可靶向调控NR6A1的表达。本研究表明，上调NR6A1表达能显著减弱miR-196a inhibitor对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调控作用，并显著减弱miR-196a inhibitor对Ki-67、VEGF和MMP-9表达的抑制作用。Ki-67抗原是一种与细胞增殖相关的核蛋白，在肿瘤细胞增殖活性的检测中，Ki-67是最可靠的指标之一[23]。VEGF是一种高度特异性的促血管生成因子，在多种恶性肿瘤中高表达，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[24]。MMP-9作为MMPs家族的成员，是一种重要的细胞外基质蛋白水解酶，能够水解基膜，从而促进肿瘤迁移[25]。因此，miR-196a对宫颈癌Hela细胞生存和运动能力的影响与靶向调控NR6A1表达有关。

综上所述，下调miR-196a表达能降低宫颈癌细胞增殖倍数、侵袭细胞数和细胞划痕闭合率，并显著提高癌细胞凋亡率；同时，进一步上调NR6A1表达能显著减弱miR-196a对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调控作用。提示miR-196a能通过促进NR6A1表达在宫颈癌中发挥致癌作用，下调miR-196a表达能够抑制NR6A1表达，从而延缓宫颈癌的发展。本研究首次探讨了miR-196a与NR6A1的靶向关系及miR-196a通过靶向NR6A1在宫颈癌中的作用，为宫颈癌发生发展机制的探究提供了新的方向。