昆明汉族2 型糖尿病患者GAS6 基因rs8191974位点的多态性、血浆水平变化及意义

董雪娥，李会芳，王玉明，刘伟军

昆明医科大学第一附属医院，昆明650031

2 型糖尿病（T2DM）是一种遗传和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性复杂疾病，其发病的主要因素为胰岛素抵抗（IR）和β细胞功能缺陷导致胰岛素相对或绝对不足和（或）作用障碍。生长停滞特异性蛋白6（GAS6）属于维生素K 依赖蛋白家族，是受体酪氨酸激酶家族TAM 受体（包括Tyro3、Axl、Mer）的共同配体。有研究表明，GAS6 可降低葡萄糖刺激的血浆胰岛素分泌水平并促进胰岛β细胞的增殖［1-2］。GAS6 基因多态性及其血浆水平与T2DM、肥胖及 IR 有相关性［3-4］，GAS6 基因 rs8191974 位点 A等位基因及血浆GAS6 水平升高可能是T2DM 患者的保护因素［5-7］；而对中国北方汉族人群的研究显示，GAS6基因rs8191974位点T等位基因是T2DM患者的保护性因素［8］。可见不同种族及不同区域的T2DM 患者基因多态性分布可能存在异质性。故本研究以昆明汉族T2DM 患者为研究对象，探讨其GAS6 基因rs8191974 位点的多态性及血浆水平变化。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017 年2—12 月就诊于本院的 T2DM 患者 352 例（T2DM 组），均符合 1999 年WHO 制订的糖尿病诊断标准［9］，均为昆明户籍且居住在昆明市，汉族。其中男178 例，女174 例，年龄（52.53 ± 10.92）岁，平均病程6.05 年。排除标准：其他类型糖尿病和（或）有糖尿病急性并发症；有心脑血管、血液系统、自身免疫性及其他内分泌代谢疾病；近期有感染、手术、创伤等应激因素；严重肝肾功能不全。同期选取本院体检中心昆明地区汉族人群体检结果正常且无糖尿病史者186 例作为对照组，男101 例，女85 例，年龄（51.90 ± 5.27）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P均>0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，两组均签署知情同意书。

1.2 GAS6 基因rs8191974 位点多态性检测 采用PCR 法与单向基因测序法。DNA 提取：选用EDTA抗凝管取两组外周静脉血4 mL，按照全血基因组DNA 提取试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）说明书进行操作，将提取的DNA 溶液放置-20 ℃保存备用。PCR 扩增：PCR 反应体系 25 μL，其中DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2× Tap PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，72 ℃终末延伸7 min，共35 个循环，4 ℃保温1 min。将PCR 扩增产物和GAS6 基因rs8191974 位点的引物（上游序列5'-TTGAGCGCACCTTGCGTGTG-3'、下游序列5'-ACTGTGAGCTGGGAGTTGCC-3'）送上海生物工程有限公司，检测其基因多态性。

1.3 血浆GAS6 水平检测 采集两组清晨空腹外周静脉血4 mL，置于EDTA 抗凝管中颠倒混匀，3 000 r/min 离心10 min，离心半径15 cm，分离血浆，于-20 ℃冻存。采用ELISA 双抗体夹心法检测血浆GAS6。ELISA 试剂盒购自无锡东林科技发展有限责任公司。

1.4 HbA1c、FPG 检测及 IR 指数（HOMA-IR）计算 血液标本采集同1.3，用高效液相色谱法检测HbA1c、葡萄糖氧化酶法检测FPG、放射免疫法检测空腹胰岛素（FINS），计算 HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5［10］。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料用中位数±四分位间距［M（Q）］表示，组间比较采用秩和检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；用Spearman 相关法分析血浆GAS6 水平与HbA1c、FPG、HOMA-IR 的相关性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基因测序结果 GAS6 基因rs8191974 位点的三种基因型分别为GG、GA、AA。两组均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P均>0.05）。两组GAS6基因rs8191974位点基因型频率比较差异有统计学意义（χ2=11.360，P<0.05）。见表1。

表1 两组GAS6基因rs8191974位点等位基因型频率比较（%）

2.2 两组 HbA1c、FPG、HOMA-IR 及血浆 GAS6 水平比较 两组三种基因型之间HbA1c、FPG、HOMAIR 比较差异无统计学意义（P均>0.05），而GAS6 水平比较差异有统计学意义（P<0.05）。两组GG 基因型血浆GAS6 水平比GA、AA 基因型低（P均<0.05）。见表2。

2.3 T2DM 组 血 浆 GAS6 水 平 与 HbA1c、FPG、HOMA-IR 的相关性 剔除年龄、性别因素后，行偏相关分析，T2DM 组血浆 GAS6 水平与 HbA1c、FPG、HOMA-IR无相关性（r分别为-0.217、-0.344、-0.186，P均>0.05）。

表2 两组HbA1c、FPG、HOMA-IR及血浆GAS6水平［M（Q）］

3 讨论

GAS6 基因由678 个氨基酸组成，其氨基酸序列与血浆抗凝蛋白S 有44%的同源性，对细胞生长起负性调节作用［11］。Axl 是受体酪氨酸激酶家族成员之一，与Gas6 结合后激活自身酪氨酸激酶活性，调节细胞的增殖、凋亡、趋化、黏附和识别等多种生理功能［12］。有研究报道，通过基因敲除阻断GAS6/Axl信号通路会使小鼠的血糖水平升高，脂肪沉积增加，导致小鼠T2DM 发病。GAS6/Axl信号通路的激活有助于促进骨骼肌PI3K/AKT的磷酸化，增加骨骼肌中Glut4向细胞膜的转位，促进小鼠体内血糖吸收［13］。

GAS6 与炎症、肥胖和IR 相关，但结论存在争议。如有研究显示，在青少年男性中，GAS6 基因rs8191974 位点 A 等位基因和 rs8191973 位点 C 等位基因携带者的腰围、BMI、IL-6 和 hs-CRP 水平低于GG基因型，同样Axl基因rs2304232位点A等位基因携带者的IL-6、胰岛素及HOMA-IR 水平低于GG 基因型。提示肥胖和炎症的易感性可能与GAS6 基因rs8191974、rs8191973 及 Axl 基因 rs2304232 位点的GG 基因型存在相关性［14］。但对亚洲成年人的研究却未发现肥胖与GAS6 基因多态性存在相关性［15］。本研究发现，T2DM 组 GAS6 基因 rs8191974 位点 GG基因型频率高于对照组，而GA 和AA 基因型频率低于对照组，但三种基因型HbA1c、FPG、HOMA-IR 比较差异无统计学意义，而GG 基因型血浆GAS6 水平比GA、AA 基因型低。因此，推测昆明汉族T2DM 患者 GAS6 基因 rs8191974 位点 GA、AA 基因型携带者发生T2DM的风险比GG基因型携带者低。

有研究显示，成年女性血浆GAS6 水平与胰岛素敏感性存在相关性，与腰围、腰臀比（WHR）、BMI、HOMA-IR、IL-6 水平呈负相关；然而，在成年男性中却未发现血浆GAS6 水平与上述指标有相关性，原因可能为性激素对GAS6/TAM 系统的潜在调节作用［16-17］。不同人群中血浆 GAS6 与炎症、肥胖、IR 的相关性有差异，考虑可能与性别、年龄及性激素等因素有关。目前多项研究结果显示，血浆GAS6 水平与血糖水平呈负相关［17-20］，因此，糖尿病与 GAS6 基因多态性有关，血浆GAS6 水平对肥胖、IR、糖代谢及炎症的发生也有影响［14，21-23］。而本研究发现，血浆GAS6水平与HbA1c、FPG、HOMA-IR无相关性，考虑T2DM 是一种遗传异质性疾病，遗传和环境因素共同参与、相互作用导致疾病的发生。因此，研究结果的不一致可能与种族和地域的异质性及实验方法、样本量等因素有关。

综上所述，昆明地区汉族T2DM 患者的GG 基因型频率、G 等位基因频率高，而GA、AA 基因型频率及A 等位基因频率低，且其血浆GAS6 水平低。T2DM 是一种多基因遗传病，其遗传基础不能用单个基因效应来解释。因此，为进一步阐明GAS6 基因多态性及其血浆水平与T2DM 的关系，还需进行多中心临床研究，收集不同种族和区域的人群，加大样本含量，使研究结果更科学、更全面。