甲状腺乳头状癌组织中lncRNA MIR31HG表达变化及意义

张小丽，海涛，刘文清，李非

首都医科大学宣武医院，北京100053

甲状腺癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发病率呈现快速增长的趋势［1］。甲状腺癌常见的病理类型包括甲状腺乳头状癌（PTC）、髓样癌、未分化癌及滤泡状癌。其中，PTC最为常见，约占所有病理类型的90%［2］。目前，甲状腺癌的治疗包括手术治疗、促甲状腺激素抑制治疗、放射性碘治疗及分子靶向治疗等。但部分患者肿瘤恶性程度较高，易发生局部浸润及远处转移，患者预后较差［3］。因此，深入研究PTC发生发展的分子机制，对于寻找新的诊断及治疗靶点，改善患者的预后，具有重要临床价值［4］。长链非编码RNA（lncRNA）MIR31HG 基因位于染色体9p21.3，该基因编码产生长200～300 bp长链非编码RNA，能与多梳蛋白抑制复合体1结合，参与调节正常细胞的分化、发育等生物学过程［5］。有研究报道，lncRNA MIR31HG 在肺癌、胃癌及结直肠癌等多种肿瘤中均存在表达异常升高的现象，其通过抑制下游肿瘤抑制因子p16 的表达，促进肿瘤细胞的恶性进展［6-7］。此外，在体外细胞实验中发现，PTC 细胞中lncRNA MIR31HG 的表达能够促进肿瘤细胞内蛋白激酶B（AKT）的磷酸化，促进PTC细胞的增殖和迁移［8］。本研究通过检测PTC 组织中lncRNA MIR31HG的表达，初步探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2014 年 1 月—2015 年 1 月本院确诊为 PTC 的患者 86 例，男 30 例，女性 56 例；年龄30～66（49.2 ± 6.5）岁；伴淋巴结转移39 例，无淋巴结转移 47 例；肿瘤直径≤2 cm 38 例，>2 cm 48 例；伴局部浸润35 例，无局部浸润51 例；肿瘤TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期54例，Ⅲ、Ⅳ期32例。患者纳入标准：均为首次诊治且经病理学检查明确诊断为PTC；未接受放化疗及免疫治疗；临床资料完整，患者及家属对本研究知情同意并签字。排除标准：PTC复发；合并PTC家族遗传病病史、精神疾病病史；合并甲状腺功能亢进等内分泌系统疾病。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 PTC 及癌旁正常组织中lncRNA MIR31HG 表达检测 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法。收集PTC患者经甲状腺全切或部分切术中新鲜肿瘤组织及癌旁正常组织（距离肿瘤边缘>2 cm，经病理学检查明确诊断），TRIzol 法抽提组织RNA，紫外分光光度计测组织RNA 的浓度。随后进行反转录合成cD⁃NA。以 cDNA 为模板，进行 qPCR 反应。qPCR 反应条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共40 个循环。反应体系：2×SYBR Premix 10 μL、上游及下游引物各 0.5 μL、cDNA 模板 1 μL、ddH2O 8 μL。以U6 为内参，用 2-ΔΔCt法计算组织中 lncRNA MIR31HG的相对表达量。U6 上游引物序列：5'-GATTATC⁃GGGACCATTCCACTG-3'，下游引物序列5'-GATCT⁃GGTTCCCAATGACTGTG-3'；lncRNA MIR31HG上游引物序列 5'-TTCTGTCCTCCTACTCGGACCC-3'，下游引物序列5'-TTCTGTCCTCCTACTCGGACCC-3'。

1.3 随访 对所有PTC患者自出院起开始随访，每半年进行1次门诊随访，记录患者复发、转移及生存情况，随访截至2020年2月或患者死亡，统计5年总体生存率（OS）。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料用±s表示，比较采用t检验；用 Kaplan-Meier生存曲线（Log-rank 检验）分析PTC 患者预后；COX回归分析PTC 患者不良预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC 及癌旁正常组织中lncRNA MIR31HG 表达比较 PTC 组织、癌旁正常组织中lncRNA MIR31HG 相对表达量分别为 1.472 ± 0.309、0.611± 0.123，PTC 组织中 lncRNA MIR31HG 相对表达量较癌旁正常组织高（t=24.008，P<0.05）。

2.2 PTC 组织中lncRNA MIR31HG 表达与患者临床病理特征的关系 不同性别、年龄患者PTC 组织中lncRNA MIR31HG 的表达比较差异无统计学意义（P均>0.05）。TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期，肿瘤直径>2 cm、局部浸润及伴淋巴结转移的患者PTC 组织中ln⁃cRNA MIR31HG 表达高于 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期，肿瘤直径≤2 cm、无局部浸润及无淋巴结转移的患者（P均<0.05）。见表1。

2.3 PTC 组织中lncRNA MIR31HG 表达与患者预后的关系 随访2～60（38.2±5.5）个月，随访期间无失访病例，死亡10例，存活76例，5年OS为88.3%（76/86）。以 PTC 组织中 lncRNA MIR31HG 表达的平均数1.468为界值，分为高表达组42例，低表达组44 例 。 lncRNA MIR31HG 高 表 达 组 5 年 OS 为78.6%（33/42），低表达组5 年OS 为97.7%（43/44）。高表达组 5 年 OS 低于低表达组（χ2=4.949，P<0.05）。

2.4 PTC患者预后的影响因素 lncRNA MIR31HG高表达、肿瘤TNM 分期高及淋巴结转移是PTC 患者预后不良的独立危险因素，见表2。

表1 PTC组织中lncRNA MIR31HG表达与患者临床病理特征的关系（-x± s）

3 讨论

甲状腺癌是常见的内分泌系统肿瘤，女性发病率较高。甲状腺癌的病理类型中以PTC 最为常见。多数PTC 患者预后较好，但仍有少数患者出现复发及转移等，甚至进展为未分化型甲状腺癌，危及患者生命［9］。因此，深入研究PTC 的发病及疾病进展的机制，有助于发现新的PTC 早期诊断指标及治疗药物的研发。目前研究认为，肿瘤的发生与遗传因素、环境因素等有关，涉及癌基因的过度激活和抑癌基因的失活，多条信号传导通路如丝裂原激活的蛋白激酶通路、AKT 通路的过度激活导致肿瘤细胞过度增殖、凋亡抑制及咋了血管生成增加，促进肿瘤的发生发展［10］。肿瘤细胞内信号传导通路受到多种因素调控。非编码RNA（ncRNA）是近年来发现的调控基因表达的重要分子，在转录水平、翻译水平、翻译后修饰等各水平影响下游靶基因表达，调控细胞增殖、分化及凋亡等过程［11］。

lncRNA 是长度大于200 bp的ncRNA，以碱基互补配对的方式与靶基因结核调控基因的转录、蛋白质翻译等过程，与感染、自身免疫性疾病及恶性肿瘤等疾病关系密切［12］。lncRNA MIR31HG 基因位于人类9号染色体，基因全长1 126个碱基，在结直肠癌、肝癌及膀胱癌等多种人类恶性肿瘤中均存在异常表达升高的现象，是肿瘤发生发展过程中的重要致癌基因［13］。YAN 等［14］报道 lncRNA MIR31HG 的表达水平升高可结合并抑制miR-575 的表达，从而促进致瘤样因子7的表达，导致肿瘤细胞的过度增殖、浸润转移能力增加。本研究表明，PTC 患者癌组织中lncRNA MIR31HG 表达明显较癌旁正常组织升高，其机制可能与lncRNA MIR31HG 基因的表观遗传学调控有关。 研究表明，正常细胞中lncRNA MIR31HG 基因启动子处于高甲基化的状态；而肿瘤发生时，lncRNA MIR31HG 基因的甲基化转移酶活性升高，导致lncRNA MIR31HG 基因启动子区去甲基化，促进lncRNA MIR31HG基因的转录，导致肿瘤中 lncRNA MIR31HG 表达水平升高［15］。本研究中肿瘤分期高、肿瘤直径>2 cm、伴局部浸润及伴淋巴结转移患者癌组织中lncRNA MIR31HG 表达水平较高，表明癌组织中lncRNA MIR31HG 的高表达促进PTC 的发生发展。有研究报道，肿瘤中lncRNA MIR31HG 可作为内源竞争性 RNA 结合 miR-34a，促进癌基因c-myc 的表达，进而促进肿瘤细胞的增殖及血管生成，导致肿瘤发生恶性进展［16］。体外细胞实验中亦研究表明，非小细胞肺癌细胞系PC9 中ln⁃cRNA MIR31HG的过表达能够通过激活表皮生长因子受体/AKT 途径，抑制线粒体途径凋亡，抑制细胞凋亡，导致肿瘤的恶性进展［17］。近年来有研究报道，肿瘤中lncRNA MIR31HG 的高表达与患者的不良生存预后有关，有可能成为新的肿瘤诊断治疗靶点［18］。本研究中，lncRNA MIR31HG 高表达组 PTC患者的5 年OS 明显较低，表明PTC 组织中lncRNA MIR31HG 的表达与预后有关，因此检测癌组织中lncRNA MIR31HG 的表达有可能成为判断患者生存预后的肿瘤标志物。本研究进一步通过COX 回归分析PTC 患者预后的危险因素，结果lncRNA MIR31HG 高表达、肿瘤TNM 分期高及淋巴结转移是PTC 患者预后不良的独立危险因素。因此，PTC组织中lncRNA MIR31HG 可能是促进肿瘤进展的重要肿瘤标志物，有助于判断PTC患者的预后。

表2 PTC患者预后不良危险因素的Cox多因素分析

综上所述，PTC 组织中 lncRNA MIR31HG 表达升高，与PTC 患者不良预后有关。 lncRNA MIR31HG 高表达、肿瘤TNM 分期及淋巴结转移是影响PTC 患者预后不良的独立危险因素，有望成为新的判断PTC患者生存预后的肿瘤标志物。但限于本研究样本例数有限，有待大样本多中心研究进一步研究lncRNA MIR31HG的临床意义。