天麻素腹腔注射对慢性偏头痛大鼠的治疗作用及机制

宋维伟，陈金波，张德福，郑海非，宋晓文，董晓梦，鲁文先

滨州医学院附属医院，山东滨州256600

偏头痛是一种原发性疾患，其发作时为中度至重度头痛，伴有恶心、呕吐或畏光、畏声等症状，部分患者伴有短暂的局灶性神经症状。目前偏头痛分为六大类，包括先兆偏头痛、无先兆偏头痛、慢性偏头痛、偏头痛并发症、很可能的偏头痛以及可能与偏头痛相关的周期综合征［1］。慢性偏头痛是一种高度致残的疾病，其特征是每月至少15 d头痛，其中至少8 d必须符合偏头痛标准［1］，其患病率为1%～2%，每年约2.5%的偏头痛患者进展为慢性偏头痛［2］。引起偏头痛慢性化的病理生理机制尚不完全清楚。且慢性偏头痛仍未有明确的诊治方案。近年来，中药治疗慢性偏头痛越来越受到关注。天麻素作为天麻制剂主要的活性物质，其缓解慢性偏头痛的疗效受到临床肯定。2019 年 9 月—2020 年 1 月，我们探讨了天麻素对慢性偏头痛大鼠的治疗作用及机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 清洁级成年雄性SD 大鼠24 只，体质量250～300 g，3～4 月龄，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，饲养于滨州医学院SPF 级动物饲养中心，12 h 明暗环境循环，温度20～25 ℃，湿度40%～70%，随意饮食。天麻素、托吡酯（上海源叶生物科技有限公司），脑源性神经营养因子（BDNF）抗体、降钙素基因相关肽（CGRP）抗体、β-actin 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、Western blotting 试剂盒（博士德生物公司），FITC-驴抗兔IgG（美国Abcam公司）、RT-PCR 试剂盒（普洛麦格生物技术有限公司），BDNF、CGRP、GAPDH 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。电子称重仪及高精度电子天平（法国Bioseb 公司），Vonfery 电子机械痛测试仪（美国IITC公司），BW-Plantar 390 足底热测痛仪（美国IITC 公司），实时荧光定量PCR 仪（罗氏公司），酶标仪、电泳仪、湿转转膜仪（美国Bio-Rad 公司）、低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 动物分组、药物干预及模型制备 将大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、托吡酯组、天麻素组各6 只。采用间歇性腹腔注射硝酸甘油（NTG）建立慢性偏头痛大鼠模型［3-4］，即每隔1 d给予模型组、托吡酯组、天麻素组腹腔注射1次硝酸甘油（NTG）10 mg/kg，空白对照组腹腔注射生理盐水5 mL，均注射5 次。注射NTG 前30 min，模型组、托吡酯组、天麻素组分别给予腹腔注射生理盐水5 mL、托吡酯 30 mg/kg、天麻素 200 mg/kg，每日 1 次，共干预11 d；空白对照组不给予药物干预。

1.3 大鼠行为学观察 在干预第3、5、7、9、11天，将大鼠置于安静环境中观察并记录大鼠挠头、打转及爬笼次数。行为学评分标准［5］：挠头连续10 次计1分，每增加1次加计0.1分；打转2次计1分，每增加1次加计1分；爬笼3次计1分，每增加1次加计1分。

1.4 大鼠疼痛阈值检测 干预第3、5、7、9、11天给予NTG前后测试各组机械阈值与热痛阈值，于08：00—15：00 弱光安静条件下进行测试。大鼠在刺激下抬起或抖动爪子被认为是目标反应。采用电子Vonfrey测痛仪，重复测量3 次，每次间隔3 min，取其平均值作为大鼠机械痛阈；采用足底热测痛仪测定大鼠热缩足潜伏期，重复测量3 次，每次间隔2 min，取平均值作为大鼠热痛阈。

1.5 大鼠三叉神经节（TG）及三叉神经脊束尾侧核（TNC）中BDNF、CGRP mRNA 表达检测 采用RTPCR 法。在第11 天完成痛阈测定后用水合氯醛深麻醉大鼠，置于冰上取大鼠TG、TNC 于-80 ℃保存。用RNA 提取试剂盒将组织裂解稀释提取总RNA，反转录为cDNA，于-20 ℃保存。设计BDNF、CGRP 引物，用GAPDH 作为内参。BDNF 上游引物5'-TGT⁃GACAGTATTAGCGAGTGGGT-3'，下 游 引 物 5'-CGATTGGGTAGTTCGGCATT-3'；CGRP上游引物5'-AGAAGAGATCCTGCAACACTGCCA-3'，下 游 引 物5'-GGCACAAAGTTGTCCTTCACCACA-3'； GAPDH上游引物5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游引物5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。PCR扩增：反应体系20 μL，2×AceQ qPCRGreen Mas⁃ter Mix（High ROX Premixed）10 μL、Primer1 0.4 μL、Primer2 0.4 μL、Template cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环40次。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.6 大鼠 TG、TNC 内 BDNF、CGRP 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。在第11 天完成痛阈测定后用水合氯醛深麻醉大鼠，置于冰上取TG、TNC放入灭菌EP管中加入裂解液及蛋白酶抑制剂，使用匀浆器将组织磨成匀浆状态，4 ℃12 000 g离心10 min。采用BCA 法检测上清液中的蛋白浓度。加入上样缓冲液和裂解液将蛋白样品的浓度配平，100 ℃加热5 min 使蛋白变性，分装后保存于-80 ℃冰箱备用。配置SDS-PAGE 胶，加入蛋白质样本电泳后转移到PVDF 膜。将膜浸泡在封闭缓冲液中室温1 h。加一抗BDNF（1∶200）、CGRP（1∶500）、β-ac⁃tin（1∶1 000）4 ℃孵育1 夜。用 TBST 清洗 3 次，每次10 min，加二抗室温孵育1 h。膜在TBST 中再次洗涤3 次，每次10 min，曝光后用Image J 图像分析软件检测目的条带校正后的灰度值，以目的条带与内参的灰度比值表示其相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS18.0 统计软件。计量资料以±s表示，比较采用重复测量方差分析或单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni 法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点痛阈比较 与空白对照组比较，模型组不同时间点基础机械痛阈、基础热痛阈、急性机械痛阈、急性热痛阈均低（P均<0.05）；与模型组比较，托吡酯组、天麻素组不同时间点基础机械痛阈、基础热痛阈、急性机械痛阈、急性热痛阈均高（P均<0.05）；天麻素组不同时间点基础机械痛阈、基础热痛阈、急性机械痛阈、急性热痛阈与托吡酯组比较差异无统计学意义（P均>0.05）。见表1。

表1 各组不同时间点的痛阈值（±s）

表1 各组不同时间点的痛阈值（±s）

组别空白对照组干预第3天干预第5天干预第7天干预第9天干预第11天模型组干预第3天干预第5天干预第7天干预第9天干预第11天托吡酯组干预第3天干预第5天干预第7天干预第9天干预第11天天麻素组干预第3天干预第5天干预第7天干预第9天干预第11天n 6 6 6 6基础机械痛阈（g）52.00±2.78 55.00±7.50 43.00±6.98 48.00±7.83 49.00±3.57 49.00±6.74 40.00±4.27 33.00±4.84 30.00±2.42 39.00±1.45 49.00±6.74 40.00±4.27 33.00±4.84 30.00±2.42 39.00±1.45 52.00±5.12 54.00±7.67 34.00±2.96 24.00±4.55 26.00±3.33基础热痛阈（s）13.47±1.46 10.60±2.59 13.00±1.88 10.00±0.83 9.80±0.68 14.42±1.53 6.30±1.02 5.18±0.97 5.30±0.53 4.70±1.05 13.52±1.39 9.49±0.19 9.1±0.46 10.80±1.25 10.64±1.21 14.07±2.38 9.89±0.82 8.78±1.44 8.60±1.34 9.30±1.66急性机械痛阈（g）43.00±2.30 39.00±4.52 49.00±3.67 53.00±3.85 47.00±1.74 18.00±3.56 12.00±3.05 11.00±2.56 8.00±1.72 7.00±1.78 48.00±3.08 40.00±3.31 31.00±5.15 27.00±5.54 30.00±3.64 41.00±1.57 37.00±2.31 31.00±2.31 25.00±3.57 29.00±3.00急性热痛阈（s）12.51±2.21 9.39±1.35 12.00±3.45 12.87±2.40 9.00±1.67 6.48±0.93 5.50±0.57 5.00±0.61 4.60±0.90 4.30±0.69 8.06±1.04 8.5±2.01 7.27±1.34 7.00±1.10 8.1±1.45 8.85±1.70 8.16±1.45 7.03±1.56 6.98±1.00 6.88±1.27

2.2 各组干预前后行为学评分比较 干预前各组行为学评分比较差异无统计学意义（P均>0.05）；干预后除空白对照组外，其他各组行为学评分较治疗前升高（P均<0.05）。干预后，与模型组比较，托吡酯组、天麻素组行为学评分低（P均<0.05）；天麻素组行为学评分与托吡酯组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 各组不同部位BDNF、CGRP mRNA 表达比较 与空白对照组比较，模型组BDNF、CGRP mRNA 相对表达量高（P均<0.05）；与模型组比较，托吡酯组、天麻素组CGRP、BDNF mRNA 相对表达量低（P均<0.05）；天麻素组CGRP、BDNF mRNA 相对表达量与托吡酯组比较差异无统计学意义（P均>0.05）。见表3。

表2 各组干预前后的行为学评分（分，±s）

表2 各组干预前后的行为学评分（分，±s）

组别空白对照组模型组托吡酯组天麻素组n 6 6 6 6行为学评分干预前2.20±0.28 2.50±0.46 2.50±0.45 2.70±0.60干预后2.10±0.29 14.40±1.47 8.10±0.98 7.60±0.57

2.4 各组不同部位BDNF、CGRP 蛋白表达比较与空白对照组比较，模型组BDNF、CGRP 蛋白相对表达量高（P均<0.05）；与模型组比较，托吡酯组、天麻素组 CGRP、BDNF 蛋白相对表达量低（P均<0.05）；天麻素组 CGRP、BDNF 蛋白相对表达量与托吡酯组比较差异无统计学意义（P均>0.05）。见表4。

表4 各组不同部位BDNF、CGRP蛋白的相对表达量（±s）

表4 各组不同部位BDNF、CGRP蛋白的相对表达量（±s）

组别空白对照组模型组托吡酯组天麻素组n 6 6 6 6 BDNF蛋白TG 0.45±0.02 0.61±0.01 0.48±0.02 0.48±0.01 TNC 0.24±0.01 0.49±0.02 0.38±0.01 0.38±0.02 CGRP蛋白TG 0.74±0.01 0.98±0.03 0.78±0.01 0.80±0.07 TNC 0.49±0.01 0.94±0.09 0.64±0.04 0.70±0.01

表3 各组不同部位BDNF、CGRP mRNA的相对表达量（±s）

表3 各组不同部位BDNF、CGRP mRNA的相对表达量（±s）

组别空白对照组模型组托吡酯组天麻素组n 6 6 6 6 BDNF mRNA TG 1 4.30±0.17 2.80±0.24 2.60±0.07 TNC 1 3.30±0.22 1.90±0.20 1.85±0.12 CGRP mRNA TG 1 5.20±0.30 2.87±0.08 3.00±0.07 TNC 1 4.70±0.08 3.00±0.20 3.05±0.13

3 讨论

偏头痛通常是一种发作性疾病，但随着发作频率和程度的增加会造成偏头痛慢性化。目前应用于预防慢性偏头痛的药物并非专门用来治疗偏头痛，CGRP 拮抗剂也在临床试验阶段。不足50%的慢性偏头痛患者对现有治疗感到满意，仍有部分患者对目前的疗法表示无效或耐受性差［6］；且多数治疗慢性偏头痛的药物不良反应大。中药天麻在我国有两千多年的药用历史，天麻素是天麻制剂主要活性成分之一。研究发现，天麻素通过降低伤害性初级感觉神经元的兴奋性而抑制糖尿病性神经痛大鼠触摸痛和痛觉过敏［7］；通过调节神经肽降低大鼠体内一氧化氮水平来预防急性偏头痛［8］。

目前慢性偏头痛的病理生理机制尚不明确，慢性偏头痛患者的感觉阈值降低而易感性增加，这提示中枢及外周敏化慢性偏头痛发生发展中发挥作用。中枢敏化是由C纤维伤害性感受器持续输入引起的脊髓和延髓背角神经元兴奋性增加所致。重复刺激三叉神经纤维可以导致伤害性神经递质（CGRP、谷氨酸）和（或）离子通道或感觉性受体表达增多，使外周神经元即脑膜和硬脑膜三叉神经感觉传入神经元兴奋性增加，兴奋性冲动继续上传至丘脑，进一步促进中枢敏感化，导致偏头痛发作。持续的中枢及外周敏化可能导致机体对刺激产生疼痛夸大，自觉疼痛时间延长，对正常无害的刺激产生痛觉反应。其最常见临床表现为皮肤超敏（CA），这是一种以普通的非伤害性刺激引起皮肤异常疼痛为特征的神经系统状况［9］。临床研究发现，大多数慢性偏头痛患者在发作过程会经历CA。CA 被认为是慢性偏头痛患者对曲普坦治疗反应差的预测因子，也是疾病进展的危险因素及对治疗药物药效的预测因子。本研究使用慢性偏头痛相关动物模型［3-4］，通过反复给予NTG 使大鼠产生两种不同的疼痛状态，即每次注射NTG 后出现急性痛觉过敏，随着时间推移逐渐发展为慢性痛觉过敏，这种慢性基础痛敏在停止NTG 后持续数天，以模拟偏头痛慢性化状态。该模型已经进行了测试，被认为是研究慢性偏头痛相关疼痛的可靠动物模型［4］。本研究刺激慢性偏头痛大鼠足底皮肤发现，模型组大鼠痛阈明显下降，与模型组比较，托吡酯组、天麻素组大鼠疼痛阈值增高，提示托吡酯及天麻素可以抑制大鼠痛阈的降低，阻止NTG 诱导的慢性偏头痛大鼠基础超敏反应和急性超敏反应。

近年来，BDNF 在调节疼痛信号和中枢敏化中的作用备受关注。BDNF 是脑组织中最丰富的神经营养蛋白，主要从猪脑中分离出来，属于神经生长因子家族，是由BDNF 基因编码的蛋白质，可由多种细胞（感觉神经元、运动神经元、免疫细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞）产生［10］。BDNF 广泛参与了神经生理过程，被认为是神经可塑性的驱动力，对中枢神经系统的神经生长、发育和存活具有重要作用，是中枢和周围疼痛反应的重要调节剂。数据表明，BDNF 拮抗剂减弱了甲醛诱导的痛觉过敏和角叉菜胶诱导的热痛觉过敏［11］。在促成中枢敏化的机制中，N-甲基-d-天冬氨酸（NMDA）受体的激活起着关键作用。BDNF 激活trkB 受体会导致NMDA 受体亚基NR1 和NR2B 磷酸化和激活，从而促进背角神经元的敏化参与外周及中枢敏化。有研究表明，BDNF 与CGRP 在TG 中共表达，并且有可能促进了TG 中BDNF 的释放。CGRP 是偏头痛病理生理机制的关键参与者之一。BDNF 可能通过参与三叉神经伤害性通路的中枢敏化机制参与慢性偏头痛发生发展。本研究中模型组BDNF 与CGRP 的mRNA 及蛋白表达均上调，可见二者参与了慢性偏头痛的发生发展。

本研究结果显示，托吡酯可有效抑制由NTG 诱导的慢性偏头痛大鼠的急性及慢性痛觉过敏，而天麻素与托吡酯治疗效果相似，可有效抑制慢性偏头痛大鼠的急性及基础超敏反应。另外研究结果显示，托吡酯及天麻素可抑制BDNF 与CGRP 的表达。托吡酯通过阻断钙离子通道，可抑制三叉神经末梢释放CGRP 和谷氨酸［12］。推测托吡酯抑制了CGRP的释放，从而干扰了BDNF 的表达。天麻素可能通过抑制BDNF 及CGRP 从初级感觉伤害感受器中释放，改变了突触后神经元的兴奋性，阻止了中枢敏化的形成。

天麻素目前多用于心脑血管保护，不良反应较少，在治疗神经系统疾病方面有广阔前景。本研究证实天麻素可能通过抑制初级感觉伤害感受器中释放BDNF、CGRP，降低神经元兴奋性，改变了突触可塑性，从而预防慢性偏头痛的发生发展。这为研发天麻素及其衍生物治疗慢性偏头痛提供理论基础。