电针对急性心肌梗死小鼠心肌组织炎症反应、趋化因子及心肌细胞凋亡水平的影响

赵恬田，国海东，宣守松，李涵，邵水金，牟芳芳

上海中医药大学基础医学院人体解剖学教研室，上海 201023

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是临床常见的心血管疾病之一。AMI 起病急，病死率高[1]，预后差[2]，一直是科研工作者研究的重大课题。心肌梗死（myocardial infarction，MI）后组织损伤迅速激活免疫系统，产生炎症反应，梗死心肌产生的促炎因子如白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等激活白细胞整合素，从而吸引大量炎症细胞进入梗死区。炎症反应是心脏修复的必经过程，能促进梗死心肌的清除及心室重构，但过度的炎症反应又会导致组织损伤加重，影响心脏修复[3]。电针具有双向调节作用，研究发现，电针能提升MI 疗效，调节趋化因子表达变化和炎症反应[4-8]。因此，炎症反应和趋化因子可作为研究电针治疗MI 作用机理的切入点。本实验观察电针对AMI 模型小鼠心肌组织炎症反应、趋化因子[基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、干细胞因子（stem cell factor，SCF）、单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）]及心肌细胞凋亡水平的影响，探讨电针保护心肌的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级成年M-NSG 小鼠，雌性，30 只，体质量（20±5）g，上海南方模式生物研究中心提供，动物许可证号SYXK（沪）2019-0003。饲养于上海南方模式生物研究中心SPF 级动物实验室，自由摄食饮水。所有实验均按照上海中医药大学伦理委员会和国际动物福利标准的指导方针进行。

1.2 主要试剂与仪器

Fastking cDNA 第一链合成试剂盒（货号KR116），天根生化科技（北京）有限公司；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（货号11203ES03），上海翊圣生物科技有限公司；OCT 包埋剂（货号4583），美国Sakura 公司；CD11b（货号ab8878），美国Abcam公司；Alexa Fluor®555 山羊抗大鼠荧光二抗（货号A-21434），美国Invitrogen 公司；VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂（货号H-1200），美国VECTOR 公司；TUNEL 试剂盒（货号C1089），上海碧云天生物技术有限公司。华佗牌一次性针灸针（0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司），电针治疗仪（KWD 808I，常州英迪电子医疗器械有限公司），荧光定量PCR 仪（LightCycler 96，瑞士Roche 公司），冰冻切片机（HM525，美国Thermo Fisher Scientific 公司），倒置荧光显微镜（IX53，日本Olympus 公司），小动物呼吸机（型号7025，意大利Ugo Basile 公司）。

2 实验方法

2.1 急性心肌梗死模型建立

参考文献[9]方法，异氟烷气体麻醉小鼠，气管插管成功后，连接小动物呼吸机。碘伏消毒皮肤，于左侧第4 肋间行横切口开胸，暴露心脏，剪开心包膜，找到左冠状动脉起始点（肺动脉圆锥和左心耳之间），在其下方2～3 mm 处结扎左冠状动脉前降支，肉眼可见左室前壁颜色变白表示造模成功。关闭胸腔，逐层缝合肌肉和皮肤，术后注射青霉素预防感染。

2.2 分组及干预

取正常小鼠8 只设为对照组，正常饲养，不予任何处理。造模成功小鼠16 只（造模过程中死亡6 只）随机分为模型组和电针组，每组8 只。模型组小鼠与电针组同样束缚但不电针。电针组参照《实验针灸学》[10]定位双侧“内关”“心俞”。0.28 mm×15 mm一次性毫针垂直刺入2～3 mm，行提插捻转手法，左右两侧分别连接电针治疗仪，频率20 Hz 等幅疏密波，电流强度1 mA，留针30 min，每日1 次，分别治疗3 d 和7 d，每个时间点4 只小鼠。

2.3 标本采集

分别于电针治疗3 d 和7 d 时取材，小鼠麻醉处死，快速取出心脏，PBS 漂洗2 遍。弃去结扎部位以上心肌组织，结扎部位以下心肌组织沿梗死区域中央部位水平切开，分为两部分。近心底部分放入4%多聚甲醛固定，蔗糖脱水，OCT 包埋，液氮冷冻后制备冰冻切片备用；近心尖部分置入Trizol 中，用于总RNA 的提取。

2.4 免疫荧光染色

取冰冻切片，PBS 洗2 次。滴加0.5%TritonX-100，室温处理15 min，破膜，增加细胞通透性。PBS 洗3 次×5 min。正常山羊血清37 ℃封闭30 min，封闭非特异性结合位点。滴加一抗，4 ℃孵育过夜。PBS洗3 次×5 min 后滴加对应二抗，37 ℃避光孵育1 h。PBS 洗3 次×5 min。加入DAPI 染细胞核5 min，PBS洗3 次×5 min。用抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察。于100 倍显微镜下在梗死及周边区随机选取3 个视野，通过Image J 图像分析系统测量相同面积内CD11b 阳性表达的平均荧光强度，取其均数进行统计。

2.5 RT-qPCR 检测

Trizol 法提取心肌组织总RNA，进行反转录，根据PCR 扩增试剂盒说明书配制扩增反应体系混合液，PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s、52 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s 共40 个循环，72 ℃延伸5 min，反应结束后对Ct 值采用2-ΔΔCt法进行定量分析。引物序列由上海生工合成，见表1。

表1 各基因PCR 引物序列

2.6 TUNEL 染色

取固定后冰冻切片，PBS 洗2 次，0.5%TritonX-100室温处理5 min，破膜，PBS 洗2 次×5 min，每个样品加TUNEL 检测液50 μL，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗3 次×5 min，DAPI 染细胞核5 min，PBS 洗3 次×5 min。用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下观察拍照。采用Image J 图像分析系统进行定量分析。于100 倍显微镜下在梗死及周边区随机选取3个视野计数TUNEL 阳性细胞数目和细胞核数目，以两者比值的均值进行统计分析。

3 统计学方法

4 结果

4.1 电针对模型小鼠心肌组织CD11b 表达的影响

荧光显微镜观察结果显示，对照组小鼠心肌组织未观察到CD11b 阳性细胞，模型组小鼠心肌组织可见较多CD11b 阳性细胞表达，电针后小鼠心肌组织CD11b 阳性细胞减少。与对照组比较，模型组小鼠心肌组织CD11b 阳性细胞平均荧光强度显著增强，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，电针组CD11b 阳性细胞平均荧光强度明显降低，电针治疗3 d时效果较显著（P＜0.05）。结果见图1。

图1 各组小鼠梗死及周边区心肌组织CD11b 表达比较（，每组4 只）

4.2 电针对模型小鼠心肌组织炎症因子的影响

与模型组比较，电针治疗后促炎因子IL-1β 相对表达水平降低，7 d 时较明显；TNF-α 表达7 d 时显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；抗炎因子IL-10表达变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图2。

4.3 电针对模型小鼠心肌组织趋化因子的影响

与模型组比较，电针组小鼠心肌组织SDF-1 相对表达量7 d 时明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；SCF 相对表达量3 d 时明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；MCP-1 变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图3。

4.4 电针对模型小鼠心肌细胞凋亡的影响

对照组心肌组织内凋亡细胞比例极低。与对照组比较，模型组凋亡细胞比例明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，电针组3 d 时凋亡细胞比例明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图4。

图2 各组小鼠心肌组织IL-1β、TNF-α、IL-10 水平比较（，每组4 只）

图3 各组小鼠心肌组织趋化因子SDF-1、SCF、MCP-1 水平比较（，每组4只）

图4 各组小鼠梗死及周边区心肌组织凋亡水平比较（，每组4 只）

5 讨论

AMI属中医学“胸痹”范畴，是由于“血凝而不流”导致的心脏脉络不通。针灸是中医治疗的重要手段，临床治疗心血管疾病众多穴位中，内关、心俞是最常用的穴位[11-12]。内关属手厥阴心包经络穴，也是八脉交会穴之一，与心脏关系密切。心俞为心之背俞穴，是心之经气输注出入之处，《素问·举痛论篇》有“或心与背相引而痛者………寒气客于背俞之脉………其俞注于心，故相引而痛”。

以往研究[13-14]及本课题组前期实验均表明，电针“内关”“心俞”对AMI 后心功能具有保护作用，但其机制仍不明确。MI 发生后，IL-1β、TNF-α 等大量炎症因子被释放，诱导炎性细胞趋化至损伤心肌组织[15]。强烈的炎症反应可导致凋亡加重，梗死区扩大。本实验观察到，AMI 模型小鼠梗死及周边区域心肌组织内出现大量CD11b 阳性细胞。CD11b 是白细胞整合素家族成员之一，可标记单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞等，在细胞黏附和炎症反应中具有重要作用，其活化受到多种趋化因子的调节。本实验结果表明，AMI 后炎症反应活跃，大量炎性细胞到达心肌组织，而电针可减少AMI 小鼠心肌组织CD11b 细胞数量，抑制梗死后炎症反应，且早期效果更为明显。

本实验检测梗死区炎症因子IL-10、IL-1β、TNF-α的表达，与模型组比较，电针组梗死区抗炎因子IL-10无明显变化，促炎因子IL-1β 下调、TNF-α 上调。这些细胞因子在心脏损伤及修复中具有双面性，如TNF-α 既能促进炎症反应，也能抑制心肌细胞凋亡[16]。本实验结果提示，电针对炎症反应的分子调节机制可能具有多效性，具体机制有待进一步研究确认。

MI 后炎症反应可产生多种趋化因子，如MCP-1、SDF-1 等。本研究检测梗死及周边区趋化因子MCP-1、SCF、SDF-1 的表达。其中，SDF-1[17]和SCF[18]能诱导骨髓间充质干细胞归巢至梗死心肌组织，MCP-1则对单核细胞/巨噬细胞迁移和浸润的调节起关键作用，从而介导炎症反应[19]。由于成熟心肌细胞再生能力十分微弱[20]，给MI 的治疗造成巨大困难。移植外源干细胞或促使内源性干细胞归巢是研究方向之一，干细胞不仅具有分化为心肌样细胞的潜能，还可促进血管新生、调节梗死区微环境以减少心肌细胞死亡，从而改善心功能[21]。本研究表明，电针能促进SCF、SDF-1 表达，提示电针对自体干细胞向心肌损伤部位的迁移可能有促进作用，值得进一步研究。

综上所述，电针保护AMI 小鼠心肌的机制可能与调节AMI 小鼠梗死区炎症反应、促进趋化因子SCF、SDF-1 的表达相关，从而降低心肌细胞凋亡，本研究为阐明电针治疗AMI 提供了新思路。