砂烫对大枣主要活性成分的影响*

刘世军，鲁静，张娱，宋忠兴，崔春利，许洪波，刘红波，张军武，王少程

陕西中医药大学／陕西省中药资源产业化协同创新中心／秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育）／陕西省创新药物研究中心，陕西咸阳712083

大枣为鼠李科植物枣（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果实［1］，是药食同源品种中的佳品。《神农本草经》将大枣载为上品，“主心腹邪气，安中养脾，助十二经，平胃气，通九窍，补少气、少津液，身中不足，大惊，四肢重，和百药，久服轻身长年［2］。”大枣具有补中益气，养血安神的功效，常用于脾虚少食，乏力便溏，妇人脏躁等症［1］。《中华人民共和国药典》《伤寒论》《金匮要略》中许多处方都有大枣［3-5］。现代药理研究表明，大枣具有抗氧化、抗缺氧、抗抑郁、抗疲劳、抑制肿瘤、抗过敏、保肝、镇静、抗压、抗衰老等作用［6］。大枣含有的少量环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）活性成分，具有抗心律失常、抑菌保肝、降低血糖和胆固醇等药理作用，大枣被民间誉为“益寿果”［7］。大枣中主要含有三萜类、皂苷类、生物碱类、黄酮类、糖类、酚类等化合物及维生素、矿物质元素等［8］。

由于大枣具有丰富的化学成分和良好的药理作用，近年来，关于大枣的基础研究和相关产品层出不穷，比如大枣泡腾颗粒［9］、大枣鸡蛋发糕［10］、大枣椰浆马蹄糕［11］、大枣煎膏剂［12］、大枣抗氧化口红［13］、大豆枣糕［14］等。另外将与大枣经常配伍的生姜［15］开发成大枣红糖姜茶［16］。因产地、生长环境和采摘条件、时间不同，中药化学成分的含量会有差异。不同产地的大枣，其含有的相同或同类化学成分的含量也有一定的差异。

大枣药用从古至今多为生用，但大多会注明擘开或去核等，然而好多患者在将大枣入煎剂或者作为食疗煲汤时常未擘开。民间也有将大枣炒焦当茶饮。大枣炒炭用于治疗内痔出血。清代《本草害利》记载：“入醒胃药，但去核炒香。”明代《晋济方》记载：“凡汤用完物皆擘破。”陈振武等［17］对大枣生品、炒黄、炒焦、砂烫等炮制品的常规煎出物进行测定和比较，发现不论哪种炮制品，剖开较不剖开煎出物含量都高，且大枣煎出物百分含量（完整）：炒焦（29.16%）＞炒黄（22.31%）＞砂烫（22.28%）＞醋炙（19.78%）＞生品（9.85%）；（剖开）：炒焦（36.46%）＞醋炙（32.80%）＞砂烫（31.87%）＞炒黄（31.34%）＞生品（13.55%）。可见大枣用不同的方法炮制后，其煎出物含量也存在着一定的差异。大枣炮制后枣皮被破坏，使大枣有效成分的提取利用率增加，降低了大枣在应用中不必要的损耗，从而增加一些新的功效或者增强原有疗效，减少不良反应，缓和药性，易于粉碎，进而使大枣临床应用的范围大大增加。大枣炒制后增强了养血安神的功能，对高血压引起的头痛、失眠能起到很好的食疗效果。由于大枣砂烫后主要活性成分的含量变化文献研究较少，本研究以此为契机，对大枣砂烫后主要活性成分的含量变化进行初步研究。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料大枣（产地：陕西合阳，新疆和田）。

1.2 试剂浓盐酸（西安三浦化学试剂有限公司，批号：20170626）、甲醇（天津市天力化学科技有限公司，批号：20190108）、冰醋酸（天津市天力化学科技有限公司，批号：20180208）、氢氧化钠（天津市天力化学科技有限公司，批号：20180801）、乙酸乙酯（成都市科隆化学品有限公司，批号：2019031801）、高氯酸（成都市科隆化学品有限公司，批号：2019072201）、Folin试剂（天津市天力化学科技有限公司，批号：F9252）、硝酸铝，九水（成都市科隆化学品有限公司，批号：2017090501）、香草醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20160326）、无水乙醇（安徽安特食品股份有限公司，批号：1806073602）。对照品：芦丁（陕西乐博生化科技有限公司，批号：16122801）、齐墩果酸（陕西乐博生化科技有限公司，批号：16051205）、没食子酸（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20851）、莲心碱（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20730）。所有化学试剂均为分析纯。

1.3 仪器电子分析天平（赛多利斯科仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）、MH-500调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）、KSW 型电炉温度控制器（北京科伟永兴仪器有限公司）、箱式电阻炉（北京科伟永兴仪器有限公司）、DZKW-4电子恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）、高速万能粉碎机（天津鑫博得仪器有限公司）、岛津UV-2600紫外可见分光光度仪（日本岛津公司）、KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、C21-HT2109多功能电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 大枣炮制将大枣净选，去核，切厚片，置于干净托盘内，摊开，于50℃的烘箱内干燥。取已洗净干燥的河砂适量倒在锅内，用武火加热至滑利状态，倒入大小分档的大枣片或大枣个，不停翻动炒至大枣表皮鼓起，皱缩基本消失，表面显深褐色，有焦香气发出［18］，取出铺开晾凉（用刀刮除附着于大枣上的砂子）。将大枣生片、各大枣炮制品分别用粉碎机粉碎，得其相应的粉末。生品和炮制品的水分控制在5%以下。

2.2 活性成分提取准确称取样品0.5 g，转入50 mL离心管中。分别加体积分数80%甲醇溶液5 mL，100 W 超声提取30 min，4 000 r·min-1的转速离心10 min，离心半径10 cm，收集上清液，残渣用上述方法再提取1次，合并上清液后过滤，滤液定容至10 mL，备用［19］。

2.2.1 总酚含量测定精密称量没食子酸标准对照品1 mg，用蒸馏水溶解且定容至10 mL，得质量浓度0.1 g·L-1的标准对照品溶液，准确量取上述标准溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置10 mL容量瓶中，用蒸馏水补充至6 mL，摇匀后加入体积分数50%的Folin酚试剂0.5 mL，摇匀后静置1 min，加入1.5 mL体积分数20%Na2CO3溶液，混匀定容至10 mL，在水浴锅内75℃恒温反应10 min，取出冷却至室温，在760 nm处测定吸光度［20］。

精密量取各样品体积分数80%甲醇提取液0.1 mL转入10 mL容量瓶中，用蒸馏水补充至6 mL，摇匀后加入体积分数50%的Folin酚试剂0.5 mL，摇匀后静置1 min，加入1.5 mL的体积分数20%Na2CO3溶液，混匀定容至10 mL，在水浴锅内75℃恒温反应10 min，取出冷却至室温，于760 nm波长处测定其吸光度［20］。结果见图1，表1。

图1 总酚标准曲线

表1 大枣总酚的含量变化

大枣砂烫前后各样品中总酚的含量依次为13.163 mg·g-1、24.470 mg·g-1、23.120 mg·g-1、11.543 mg·g-1、26.596 mg·g-1，表示大枣砂烫后总酚的含量有所增加，砂烫片比砂烫个总酚的含量增加的多，可能是由于大枣外表5.0～7.5μm的角质层及4～6列厚角细胞，阻碍提取溶剂的进入和内部成分的提出［17］。大枣切成片后枣皮被破坏，比表面积增加，更易于有效成分的溶出。新疆大枣生品中总酚的含量高于陕西大枣生品，但陕西大枣经砂烫后比新疆大枣砂烫后总酚含量略高。

2.2.2 总黄酮含量测定对于中药总黄酮的测定，大多采用紫外分光光度法测定［21-22］，本实验也采用该方法对大枣总黄酮进行测定。

准确称量芦丁标准对照品2 mg，体积分数80%甲醇溶解且定容至10 mL的容量瓶中，得0.2 g·L-1的芦丁标准溶液，量取芦丁标准溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL置10 mL容量瓶中，再用体积分数80%甲醇溶液补充体积至5.0 mL，加入体积分数5%NaNO2的溶液0.3 mL，摇匀放6 min后再加0.3 mL体积分数10%Al（NO3）3溶液，摇匀，静置6 min后加入4 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，混匀后再加入体积分数80%甲醇溶液定容至10 mL，再次摇匀，10 min后在510 nm波长处测定吸光度［20］。

精密量取稀释成适当倍数的体积分数80%甲醇提取液2.0 mL，再加入体积分数80%甲醇溶液补充体积至5.0 mL，加入体积分数5%NaNO2的溶液0.3 mL，摇匀静置6 min后再加0.3 mL体积分数10%Al（NO3）3溶液，摇匀，静置6 min后加入4 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，混匀后再加入体积分数80%甲醇溶液定容至10 mL，再次摇匀，10 min后在510 nm波长处测定吸光度。结果见图2，表2。

图2 芦丁标准曲线

表2 大枣总黄酮的含量变化

总黄酮含量依次为 1.277 mg· g-1、13.480 mg·g-1、13.895 mg·g-1、3.632 mg·g-1、12.591 mg·g-1，可以看出大枣炮制后总黄酮的含量大大增加，可能是大枣经砂烫后有利于有效成分的溶出。大枣片砂烫后增加量略少于大枣个砂烫后，有可能是切片后比表面积增大，温度过高可能破坏了黄酮苷，使一部分黄酮苷分解成苷元，导致总黄酮的含量降低。这只是一种推测，具体原因有待进一步深入研究。新疆大枣生品的含量小于陕西大枣生品。砂烫后新疆大枣的总黄酮含量大于陕西大枣，这与新疆大枣个大肉厚核小可能也有一定的关系。

2.2.3 总三萜含量测定三萜类化合物是大枣的主要活性成分类群之一。《中华人民共和国药典》用齐墩果酸、白桦脂酸作为大枣定性鉴别的对照品［1］，可见这类成分在大枣的功效及药理作用方面有举足轻重的作用。

精确称取对照品齐墩果酸1.0 mg，放在10 mL容量瓶中，体积分数80%甲醇溶解并定容。最后得到质量浓度0.1 g·L-1的标准对照品。分别依次精密取对照品溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL的容量瓶中，水浴挥干体积分数80%甲醇溶剂，再分别加入0.4 mL体积分数5%香草醛冰醋酸溶液，高氯酸试剂1.6 mL，混匀后放于90℃水浴反应15 min，取出冷却至室温，乙酸乙酯定容，摇匀，在560 nm处测吸光度［20］。

精密量取体积分数80%甲醇稀释5倍，量取提取液0.1 mL，于10 mL容量瓶中，水浴挥去溶剂后，再分别加入0.4 mL体积分数5%香草醛冰醋酸溶液，高氯酸试剂1.6 mL，混匀后放在于90℃水浴反应15 min，取出冷却至室温，乙酸乙酯定容，摇匀，在560 nm波长处测定吸光度。结果见图3、表3。

图3 齐墩果酸标准曲线

表3 大枣总三萜的含量变化（±s）

表3 大枣总三萜的含量变化（±s）

-1样品稀释倍数吸光度（A） 含量／mg·g 0.330 37.080新疆砂烫（片）5 0.544 59.968新疆砂烫（个）5 0.574 63.176陕西生品5 0.334 37.508陕西砂烫新疆生品5 5 0.596 65.529

总三萜含量依次为37.080 mg· g-1、59.968 mg·g-1、63.176 mg·g-1、37.508 mg·g-1、65.529 mg·g-1，表明大枣炮制后总三萜的含量增加很多，总三萜的含量较总酚、总黄酮都高，也能体现出三萜类化合物的重要性。大枣个砂烫后增加量大于大枣片砂烫后，有可能是大枣皮在砂烫过程中对大枣三萜类成分进行了保护，防止大枣片比表面积大破坏三萜类成分。新疆大枣生品的含量略小于陕西大枣生品。

2.2.4 总生物碱含量测定精密称量2 mg对照品莲心碱置于容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至10 mL，得0.2 g·L-1的标准对照品。量取0.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL、2.1 mL、2.4 mL依次置于10 mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，在282 nm处测定吸光度［23］。

配制体积分数1%Hcl 250 mL，体积分数1%NaOH 300 mL备用。分别称取各样品0.5 g于离心管中，并贴好标签，向每个离心管中分别加入10 mL体积分数1%Hcl，调节pH＝2，浸泡2 h，使生物碱转化为生物碱盐溶于酸水中。每个离心管中分别加入体积分数1%NaOH，调节pH为9～10，使生物碱游离出来。有机溶剂萃取：分别加入无水乙醇15 mL，密封，超声处理40 min，取出离心管，过滤样品溶液，将经过过滤的溶液用无水乙醇定容到50 mL的容量瓶中，备用［23］。结果见图4，表4。

将上述制备的提取液适当稀释后于282nm波长处测定吸光度。

图4 莲心碱标准曲线

表4 总生物碱的含量

总生物碱的含量依次为5.011 mg·g-1、187.370 mg·g-1、54.428 mg·g-1、15.350 mg·g-1、233.771 mg·g-1。可以看出大枣炮制后总生物碱的含量大大增加，大枣片砂烫后增加量明显大于大枣个砂烫后。

3 讨论

从本实验结果可以看出，不论是新疆产大枣切片或不切片，还是陕西产大枣，进行砂烫炮制，其总酚、总黄酮、总三萜、总生物碱含量都增大。新疆大枣个砂烫后其总酚、总生物碱的增加量少于大枣片砂烫后，可能由于大枣切片后比表面积增加，炮制时有利于两类成分的溶出，而总三萜、总黄酮的增加量大枣个大于大枣片砂烫后，这可能由于这两类成分中的一些成分对热不稳定，大枣外皮可以对其进行保护，故大枣个总三萜、总黄酮的增加量大于大枣片。

新疆大枣生品的总酚含量大于陕西大枣生品，但是其总黄酮、总三萜、总生物碱等却小于陕西大枣生品。大枣切片后砂烫的总体效果要比大枣整个砂烫要好。试验中总生物碱的增加量特别大，具体原因有待进一步深入研究，但总成分的变化趋势还是一目了然的。

大枣砂烫后由于有效成分的含量明显增加，其养血安神的效果较生品有了一定的提高，能对失眠起到很好的辅助治疗效果。对大枣砂烫后主要活性成分含量的变化进行研究，可为大枣砂烫炮制品在临床上的应用提供一定的依据。