基于Sema3A／NRP-1／PlexinA体系探讨温阳通络方拮抗类风湿关节炎嗜神经侵袭的机制*

吴晶金，李玲玉，栗荣，殷世云

云南省中医医院，云南昆明650021

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。我国大陆地区的RA患病率约为0.2%～0.4%。其主要结局是残疾，在类风湿关节炎自然病程中，5～10年的致残率为60%，病程30年的致残率为90%，寿命缩短10～15年，而伴关节外表现者的5年生存率仅为50%［1］，极大影响了患病人群的生活质量。开展干预RA研究对于人类健康具有重要意义。成纤维样滑膜细胞类似肿瘤样生长被认为是RA发生发展的重要机制，临床抗肿瘤药物如甲氨蝶呤、环磷酰胺等亦可用于类风湿关节炎的治疗。因此，从肿瘤发病学角度研究RA，有望发现全新的治疗靶标。基于嗜神经侵袭（perineural invasion，PNI）在肿瘤浸润转移中的关键作用，PNI相关神经营养因子及其受体在RA滑膜组织中亦有表达，该研究已为少数国外学者所重视，由此推测NI可能参与了RA的病理过程。本研究拟从Sema3A／NRP-1／PlexinA体系探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物SPF级DBA／1雄性小鼠90只，8周龄，体质量（21±5）g，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（京）：2016-0011，饲养于云南省中医医院中心实验室SPF级动物房，实验前适应性喂养1周，自由摄水摄食。动物房温度维持在22～24℃，湿度维持在65%～70%。

1.2 药品与试剂温阳通络方（主要由附片、桂枝、麻黄、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中药组成），由本院药学部提供；甲氨蝶呤片，通化茂祥制药有限公司生产（批号：H22022674）。牛Ⅱ型胶原（CⅡ），sigma公司；完全弗氏佐剂（CFA），美国BD公司；信号素（Sema3A）抗体（abcam，货号：ab23393）；神经纤毛蛋白-1（NRP-1）抗体（abcam，货号：ab81321）；神经丛素（PlexinA）抗体（abcam，货号：ab23391）；β-actin抗体（abmart，货号：T40104）；HRP标记通用型二抗（Goat来源，CST，货号：7074S）；蛋白酶抑制剂（Roche，货号：11206893001）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas K1622）；SYBR Green master mix（KAPA KK4601）；DMEM（H）基础培养基（Gibco，货号：12800-017）；胎牛血清（Gibco，货号：10099-141）；0.25%胰酶（Gibco，货号：1894145）；凋亡检测试剂盒（东仁化学，货号：AD10）。

1.3 仪器掌上离心机（其林贝尔）；HITACH低温离心机（CF-16RX）；全波长分光光度计（上海UNICO）；酶标仪（Thermo）；凝胶成像仪（BIO-RAD）；垂直电泳槽（BIO -RAD）；湿式转膜槽（BIO-RAD）；定量PCR仪（ABI StepOne）；紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000）；超声破碎仪（美国Sonnic VCX310）；流式细胞分选仪（Partec GmbH CyFlow Space）。

2 方法

2.1 造模及给药按随机数字表法将DBA／1小鼠随机分为空白组，模型组，甲氨蝶呤组（10 mg·kg-1），温阳通络方低、中、高剂量（2.0 g·kg-1、4.0 g·kg-1、8.0 g·kg-1）组，每组5只。除空白组外，其余小鼠均造模。配制浓度为2 mg·mL-1的牛Ⅱ型胶原溶液，置于4℃冰箱过夜。冰浴下与CFA按1∶1比例充分混匀，制成乳剂。固定小鼠后于距鼠尾根部1 cm处注射，每只100μL。致炎第21天起每日给予相应的药物干预，模型组与空白组均给予生理盐水灌胃10 mL·kg-1。第48天末次灌胃后禁食水，第49天脱臼处死。滑膜组织备测。

2.2 滑膜组织的收集小鼠处死后，置于冰上操作，仰位固定，迅速离断四肢，用冷生理盐水冲洗干净后沿踝关节上方剪下整个关节囊，一部分常规脱钙包埋，切片备用，一部分新鲜冻存于超低温冰箱。

2.3 滑膜细胞（FLS）体外培养实验取7周龄雄性DBA／1小鼠10只，完全去除皮肤和其他软组织，无菌分离各组实验动物踝关节，操作中始终避免破损导致骨髓细胞释放，以汉克斯平衡盐溶液（HBSS）冲洗，70%乙醇清洗后将其放入盛有HBSS的100 mm组织培养板中，剪开关节间隙。加入含胶原酶IV（终浓度为1 mg·mL-1）的DMEM全培基，摇床中37℃恒温震荡消化1 h，涡旋释放滑膜细胞后将上清移入新的离心管，加入DMEM 全培基后1 100 r·min-1室温离心10 min，将沉淀重悬于全培基中，接种培养于37℃，5%CO2孵育箱。传代培养至第3代，骨髓衍生系完全去除后，第4至8代细胞可用于后续实验。将细胞分为空白组、脂多糖（lipoposaccharide，LPS）组、温阳通络方组、温阳通络方加LPS组，用流式细胞术检测滑各组膜细胞凋亡情况。

2.4 指标的检测

2.4.1 W estern Blot法检测滑膜组织每组随机选择3只小鼠的滑膜组织迅速称重，每100 mg样本加入8倍体积预冷的蛋白裂解液RIPA（含蛋白酶抑制剂，0.4 mM PMSF，1 mM Iodo，1μM Pepstatin A）匀浆30 min。提取液4℃下，离心半径8 cm，12 000 r·min-1离心30 min后取上清，BCA法蛋白定量；用PBS调至等体积，加5×SDS上样缓冲液，沸水浴5 min；SDS-PAGE凝胶电泳，每孔上样20μg。配制 5% 积层胶、10% 分离胶，胶厚0.75 mm，膜于转移液（含甲醇15%）中平衡10 min，80 V转膜120 min后将膜取出，放入含5%脱脂奶粉的TBST，室温封闭1 h。取出膜，对应一抗1∶1 000稀释，4℃过夜；TBST洗3次，每次5 min；荧光二抗1∶10 000稀释，室温结合1 h；分别用TBST和PBS各洗3次，每次10 min。使用ODYSSEY 红外双色激光成像系统对Sema3A、NRP-1、PlexinA的蛋白相对表达量进行分析。

2.4.2 RT-PCR法检测滑膜组织每组随机选择3只小鼠的滑膜组织于玻璃匀浆器中，滑膜细胞则直接加入Trizol，以离心柱法提取总RNA，进行实时定量RT-PCR实验，检测Sema3A、NRP-1、PlexinA基因表达水平。（在pubmed上查询对应物种的目的基因mRNA序列，以CDS序列设计引物。应用beacon designer 7.90设计Q-PCR引物，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.4.3 流式法检测滑膜细胞凋亡将滑膜细胞随机分为空白组、LPS组、温阳通络方组、温阳通络方加LPS组。每组设3个复孔，移除细胞培养基，PBS清洗细胞3次，0.25%胰酶消化收集细胞。PBS清洗收集好的细胞3次，离心半径8 cm，1 000 rmp·min-1离心3 min，收集细胞，用400μL结合缓冲液重悬细胞，每组每个复孔均匀分成4管。第1管为空白组（不加任何试剂）、第2管为FITC对照组（加入5μL的Annexin V-FITC）、第3管为PI对照组（加入5 μL的PI）、第4管双染组（加入5μL Annexin VFITC和5μL PI），室温避光孵育15 min。用PBS将每管液体量补至1 mL后，在流式细胞仪下检测细胞凋亡，以1～3管为组合对照，以双染组分析滑膜细胞凋亡情况。

2.5 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间数据比较采用方差分析（ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 温阳通络方对小鼠滑膜组织PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表达的影响与空白组相比，模型组小鼠滑膜组织中PlexinA、Sema3A、NRP-1的表达量明显升高（P＜0.05），与相关文章中趋势一致；与模型组相比，温阳通络方各剂量和甲氨蝶呤组可明显升高PlexinA的表达量（P＜0.05）；温阳通络方高剂量组和甲氨蝶呤组可明显升高Sema3A的表达量（P＜0.05）；温阳通络方高、中剂量组和甲氨蝶呤组可明显升高NRP-1的表达量（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 温阳通络方对小鼠滑膜PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表达水平的影响

表2 温阳通络方各组p lexinA、Sema3A、NRP-1的表达（±s）

表2 温阳通络方各组p lexinA、Sema3A、NRP-1的表达（±s）

注：与模型组相比，△P＜0.05

组别n plexinA Sema3A NRP-1空白组3 0.85±0.06△1.07±0.16△0.94±0.14△模型组3 0.41±0.15 0.64±0.09 0.65±0.05甲氨蝶呤组3 0.77±0.07△1.03±0.17△0.90±0.20△温阳通络方高剂量组3 0.81±0.19△1.02±0.18△0.94±0.08△温阳通络方中剂量组3 0.68±0.04△0.87±0.06 0.92±0.14△温阳通络方低剂量组3 0.61±0.06△0.70±0.04 0.76±0.10

3.2 温阳通络方对各组PlexinA m RNA、Sema3A m RNA、NRP-1 m RNA表达水平的影响与空白组相比，模型组可明显降低PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表达量（P＜0.05）。与模型组相比，温阳通络方各剂量组和甲氨蝶呤组可升高PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表达量（P＜0.05）。见表3。

表3 温阳通络方对各组PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表达水平的影响（±s）

表3 温阳通络方对各组PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表达水平的影响（±s）

注：与模型组相比，△P＜0.05

mRNA空白组3 1.00±0.00△1.00±0.00△1.00±0.00组别n PlexinA mRNA Sema3A mRNA NRP-1△模型组3 0.24±0.03 0.23±0.03 0.22±0.03甲氨蝶呤组3 0.84±0.08△0.85±0.07△0.85±0.06△温阳通络方高剂量组3 0.86±0.06△0.86±0.07△0.89±0.05△温阳通络方中剂量组3 0.58±0.09△0.50±0.06△0.50±0.06△温阳通络方低剂量组3 0.30±0.02△0.29±0.04△0.30±0.06△

3.3 滑膜细胞凋亡实验与正常组相比，温阳通络方＋LPS组、温阳通络方组滑膜细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与LPS组相比，温阳通络方＋LPS组、温阳通络方组滑膜细胞凋亡率明显（P＜0.05）。见图2、表4。

图2 温阳通络方对各组滑膜细胞凋亡率的影响

表4 温阳通络方对各组滑膜细胞凋亡率的影响（±s）

表4 温阳通络方对各组滑膜细胞凋亡率的影响（±s）

注：与正常组相比，*P＜0.05，与LPS组相比，△P＜0.05

／%LPS组组别n凋亡率1.11±0.06正常组3 2.53±0.12温阳通络方＋LPS组3 15.01±0.03*△温阳通络方组3 37.02±1.61 3*△

4 讨论

温阳通络方是国家级名老中医吴生元教授基于“阳虚络痹”理论总结出的治疗类风湿关节炎的效验方。全方由附片、桂枝、麻黄、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中药组成，具有温阳散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治类风湿关节炎寒湿痹阻证或风寒湿痹证。前期研究证实，温阳通络方具有良好的抗炎、镇痛、免疫调节及抑制骨破坏的作用［2-5］。《中藏经》指出：“阳者生之本，阴者死之基，阴宜长损，阳宜长益，顺阳者生，逆阳者死”“阳化气，阴成形”，阳气流通，阴气无滞，自然百病不作。阳衰阴长，风寒湿乘虚侵袭，具体表现在有形阴邪积聚。因此，阳虚邪乘，络脉痹阻可能是滑膜发生嗜神经侵袭的病机所在。

Sema3A／NRP-1／PlexinA复合体在RA滑膜组织的表达证实了嗜神经侵袭可能是RA发病的重要机制。Sema3A具有免疫调节的作用，它能与血管内皮生长因子165（VEGF165）竞争性结合NRP-1［6-15］。研究显示，Sema3A能完全阻断VEGF165信号通路，因此，其表达减少能加剧RA病程［16-20］。而NRP-1介导的信号转导是由PlexinA共受体实现的。Sema3A／NRP-1／PlexinA复合体通过小G蛋白家族的Rac和Rho实现对细胞微丝骨架的调控。其中，Rac家族与B淋巴细胞增殖激活和树突状细胞介导的T淋巴细胞激活密切相关［21-22］。由此可见，Sema3A／NRP-1／PlexinA调控体系参与了类风湿关节炎病理进程，其对RA的调控可能通过免疫调节及抗滑膜新生血管形成发挥作用。

综上所述，嗜神经侵袭可能参与滑膜增殖，是类风湿关节炎发生发展的重要机制。Sema3A／NRP-1／PlexinA调控体系在滑膜病程中可能有重要作用，其可能通过影响滑膜细胞凋亡等抑制炎症反应发展。Sema3A／NRP-1／PlexinA体系可能是温阳通络方治疗RA的效验靶点。