熊果酸预处理对急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

谢剑琳，吕君楠，胡洁，杨晓龙

邯郸市中心医院，河北邯郸056000

急性心肌梗死是指冠状动脉狭窄所致持续性缺血缺氧而引发心肌缺血性坏死，继而出现心衰、恶性心律失常甚至猝死，是临床上较为常见的急危重症，发病率逐年上升且呈现年轻化趋势，严重威胁人类的生命健康［1-3］。其中心肌梗死急性期并发心功能急剧减退是导致心源性猝死的主要原因［4］。氧化应激损伤［5-6］和炎症级联反应［7-8］在急性心肌梗死病理变化过程中发挥着重要作用。熊果酸是一种存在于天然植物中的五环三萜类化合物，具有抗氧化、抗炎等生物学活性［9-11］。本研究将制备急性心肌缺血再灌注（I／R）大鼠模型并于造模前7 d给予熊果酸进行预处理，探讨熊果酸预处理对急性心肌I／R损伤的保护作用及可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物健康清洁级SD大鼠120只，雌雄各半，8周龄，体质量（250±20）g，购自河北省实验动物中心［动物生产许可证号：SCXK（冀）2018-004］。饲养于邯郸康业制药有限公司［动物使用许可证号：SCXK（冀）2019-003］，饲养条件：温度25℃，相对湿度（60±5）%，光照黑暗各12 h交替，自由饮水进食。本实验经邯郸市中心医院伦理委员会审核批准［伦理号：HDZXLL（K）字2020-012］。

1.2 药物与试剂熊果酸购自美国Sigma公司（纯度≥98.5%，批号：89797）；盐酸维拉帕米注射液上海禾丰制药有限公司（批号：181016）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：201901016）；过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：201811009）；丙二醛（monochrome display adapter，MDA）试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：201903012）；硝基蓝四氮唑（NBT）（上海前进试剂厂，批号：191127）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：190124）；细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：181203）；白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：181130）；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：181215）。

1.3 仪器DW-2000型动物呼吸机（上海嘉鹏技术有限公司）；RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；DU700型紫外-可见分光光度计（美国Beckman Coulter公司）；SpectraMax M3型多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司）；BL-A420型动物心电图机（上海精密科学仪器有限公司）；Image-Pro Plus 6.0图像分析系统（北京麦克奥迪仪器仪表有限公司）。

2 方法

2.1 模型制备与给药将120只大鼠进行编号后按照随机数字表法进行分组。设假手术组，I／R组，熊果酸低、中、高剂量（20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、80 mg·kg-1）组和维拉帕米（2.5 mg·kg-1）组，每组20只。药物溶液配制：精确称量熊果酸后加入适量生理盐水溶液，配制浓度为40 g·L-1的熊果酸溶液，然后依次加入0.9%氯化钠溶液稀释指标浓度为20 g·L-1、10 g·L-1的熊果酸溶液，同样方法配制浓度为1.25 g·L-1的维拉帕米溶液。各组大鼠均于造模手术前7 d开始给药（2 mL·kg-1）预处理，假手术组和I／R组同步给予等体积（2 mL·kg-1）0.9%氯化钠溶液。参照张卫强等［12］报道的方法复制急性心肌I／R大鼠模型：采用冠状动脉左前降支下2 cm处结扎30 min的方法，造模过程实施心电图监测。以结扎后、再灌注前左心室壁呈灰白色、心电图ST段抬高为急性心肌I／R大鼠模型成功标志。假手术组行手术通路但不结扎冠状动脉左前降支。再灌注24 h后取材并行各指标检测。其中I／R组大鼠死亡2只，熊果酸低、中剂量组各死亡1只，其他组大鼠未出现死亡现象。

2.2 指标检测

2.2.1 监测心电图ST段变化观察并记录再灌注24 h时各组大鼠心电图ST段高度。

2.2.2 心功能指标测定麻醉后取仰卧位固定，通过小动物超声实时影像系统，取左室乳头肌水平短轴切面检测心功能指标：舒张／收缩末期左室内径（LVIDd、LVIDs）、短轴缩短率（fraction shortening，FS）、射血分数（ejection fraction，EF）、每搏输出量（stroke volume，SV），连续测量5个心动周期取平均值。

2.2.3 心肌组织病理学检查和损伤评分各组分别随机取6只大鼠，深度麻醉后开胸取心脏，4%多聚甲醛溶液固定72 h后行石蜡包埋、切片（2μm厚），经二甲苯透明、梯度酒精脱蜡后行HE染色，中性树胶封片后通过光学显微镜观察心肌组织病理学变化。损伤评分［13］：无损伤，计0分；部分间质水肿和局灶性心肌细胞坏死，计1分；大面积心肌细胞肿胀和坏死，计2分；血管浓缩和心肌纤维萎缩性坏死，计3分；弥漫性血管浓缩、出血和心肌坏死，计4分。每只大鼠观察5个视野，取平均值。

2.2.4 心脏梗死体积百分比测定各组分别随机取6只大鼠，深度麻醉后开胸取心脏，0.9%氯化钠溶液冲洗并擦拭干净后进行切片（厚约2 mm），然后置恒温37℃浓度2%的NBT溶液避光孵育30 min，每5 min翻动切片一次以使之均匀着色（灰白色为心肌梗死区），拍照后应用图像分析系统进行图像分析。

脑梗死体积百分比（%）＝［（梗死面积×切片厚度）／（切片面积×切片厚度）］×100%

2.2.5 心肌生化指标测定I／R组取剩余的6只大鼠，熊果酸低、中剂量组取剩余的7只大鼠，其余组取剩余的8只大鼠，麻醉后取心脏组织，于冰上剪碎后置离心管并加入9倍量RIPA蛋白裂解液，冰水浴中研磨匀浆，低温高速（4℃，12 000 rpm，离心半径13.5 cm）离心15 min后取上清液。严格遵照试剂盒说明步骤处理后，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，生化分析法测定CAT活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，ELISA测定IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平。

2.3 统计学处理结果以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较通过SPSS 15.0软件行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准取α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 心电图ST段监测结果与假手术组比较，I／R组大鼠心电图ST段明显抬高（P＜0.01）；与I／R组比较，熊果酸中、高剂量和维拉帕米进行预处理组明显抑制急性心肌I／R大鼠心电图ST段抬高（P＜0.05；P＜0.01）；与维拉帕米预处理组比较，熊果酸高剂量预处理组ST段高度变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠心电图监测结果

3.2 心功能指标测定结果与假手术组比较，I／R组大鼠LVIDd、LVIDs显著升高，FS、EF、SV显著降低（P＜0.05；P＜0.01）；与I／R组比较，熊果酸中、高剂量和维拉帕米进行预处理能够明显抑制急性心肌I／R大鼠LVIDd、LVIDs的升高和FS、EF、SV的降低（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高剂量预处理组LVIDs显著低于维拉帕米预处理组（P＜0.05），其他指标两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心功能指标测定结果（±s）

表1 各组大鼠心功能指标测定结果（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与I／R组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与维拉帕米组比较，＃P＜0.05；1 mmHg＝0.133 kPa

组别n LVIDd（P／mmHg）LVIDs（P／mmHg）FS／%EF／%SV（v／μL）82 187.62±25.65 I／R组18 7.32±0.35*6.22±0.49**16.51±3.08**30.49±6.47**80.47±18.25**熊果酸低剂量组19 7.20±0.41 5.98±0.53 18.20±3.19 33.59±7.03 87.08±21.39熊果酸中剂量组19 7.08±0.35 5.35±0.38△23.63±4.51△39.30±8.42△97.68±18.23△熊果酸高剂量组20 6.84±0.29△4.97±0.41△△＃29.27±6.04△△45.13±8.64△△122.56±23.18△△维拉帕米组20 6.76±0.30△5.43±0.40△26.52±5.79△△42.75±7.80△△116.34±21.95假手术组20 6.71±0.39 3.79±0.35 42.97±7.43 73.16±10.△△

3.3 心肌组织病理学检查和损伤评分结果假手术组大鼠心肌组织细胞未见病理性形态和结构改变；I／R组大鼠呈现心肌纤维条理不清、断裂和排列紊乱，心肌细胞肿胀、界限不清，炎性细胞浸润等病理性改变；熊果酸或维拉帕米预处理组能够明显抑制急性心肌I／R大鼠心肌组织细胞病变，其中熊果酸高剂量预处理组效果更为显著。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织病理学检查结果（HE，×200）

3.4 心肌组织损伤评分和心脏梗死体积百分比结果损伤评分结果显示：与假手术组比较，I／R组大鼠心肌组织损伤评分显著升高（P＜0.01）；与I／R组比较，熊果酸中、高剂量和维拉帕米组可明显降低损伤评分（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高剂量组损伤评分显著低于维拉帕米预处理组（P＜0.05）。心脏梗死体积百分比结果显示：与假手术组比较，I／R组大鼠心脏梗死体积百分比显著升高（P＜0.01）；熊果酸中、高剂量和维拉帕米组明显降低急性心肌I／R大鼠梗死体积百分比（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高剂量组对心脏梗死的抑制作用显著优于维拉帕米组（P＜0.05）。见表2，图3。

图3 各组大鼠心肌组织梗死状况（NBT染色）

表2 各组大鼠心肌损伤评分和梗死体积百分比测定结果（±s）

表2 各组大鼠心肌损伤评分和梗死体积百分比测定结果（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与I／R组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与维拉帕米组比较，＃P＜0.05

／%假手术组组别n 心肌组织损伤评分／分 梗死体积百分比6 0.00±0.00 0.00±0.00 I／R组6 7.35±1.97**46.95±8.51**熊果酸低剂量组6 6.85±2.42 42.18±9.43熊果酸中剂量组6 5.63±1.25△33.52±5.37△△熊果酸高剂量组6 3.54±0.60△△＃29.26±5.03△△＃维拉帕米组6 4.62±0.72△△35.94±6.27△△

3.5 心肌组织氧化应激指标测定结果与假手术组比较，I／R组大鼠心肌组织SOD、CAT活性显著降低且MDA含量显著升高（P＜0.01）；熊果酸中、高剂量和维拉帕米组可明显升高急性心肌I／R大鼠心肌SOD、CAT活性且降低MDA含量（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高剂量组可升高SOD活性和降低MDA含量的作用显著优于维拉帕米组（P＜0.05；P＜0.01），两组间CAT活性差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织氧化应激指标测定结果（±s）

表3 各组大鼠心肌组织氧化应激指标测定结果（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与I／R组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与维拉帕米组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别n SOD／U·mg-1 Pro CAT／U·mg-1 Pro MDA／nmol·mg-1 Pro假手术组8 67.04±8.13 4.75±0.56 3.48±0.51 I／R组6 45.81±6.64**2.98±0.74**9.26±1.43**熊果酸低剂量组 7 49.75±7.17 3.11±0.62 7.90±1.15△熊果酸中剂量组 7 54.96±6.82△3.85±0.65△6.43±1.07△△熊果酸高剂量组 8 63.14±7.73△△＃ 3.83±0.70△4.82±0.84△△＃＃维拉帕米组8 50.28±6.94 3.36±0.52 7.07±1.12△

3.6 心肌组织炎症因子含量测定结果与假手术组比较，I／R组大鼠心肌组织IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平显著升高（P＜0.01）；与I／R组比较，熊果酸中、高剂量组可明显降低I／R大鼠心肌组织IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平（P＜0.05；P ＜0.01），维拉帕米组能够明显降低ICAM-1水平（P＜0.05）；熊果酸高剂量组降低对TNF-α、IL-1β、IL-6水平作用显著优于维拉帕米组（P＜0.05；P＜0.01），两组间ICAM-1含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠心肌组织炎症因子含量测定结果（±s）

表4 各组大鼠心肌组织炎症因子含量测定结果（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与I／R组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与维拉帕米组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别n IL-1β（ρ／μg·L-1）ICAM-1（ρ／μg·L-1）IL-6（ρ／μg·L-1） TNF-α（ρ／μg·L-1 9.08 I／R组6 203.17±19.40**718.62±93.53**74.81±7.42**188.36±19.75**熊果酸低剂量组7 190.48±22.29 681.82±103.76 69.78±7.93 177.47±25.53熊果酸中剂量组7 164.61±20.31△547.05±82.36△△60.49±5.23△147.24±18.56△熊果酸高剂量组8 113.52±18.49△△＃＃495.61±64.79△△49.15±4.60△△＃＃134.58±13.51△△维拉帕米组8 189.28±20.87 568.14±95.27△假手术组8 32.04±4.75 355.13±41.07 25.06±3.38 66.94±69.43±7.29 167.32±21.68）＃

4 讨论

急性心肌梗死是目前发病率很高且仍呈上升趋势的缺血性心血管疾病，致残、致死率极高［14-15］。通过药物溶栓或介入取栓等方法及时实现梗死相关动脉再通，恢复血流灌注、挽救濒死心肌细胞、减小梗死面积，是目前临床上救治急性心肌梗死的首选方案，但I／R损伤并发症的存在却严重影响着该部分患者的预后，是临床亟待解决的难题。

给药预处理是临床上预防组织器官I／R损伤的常用方案。熊果（又名熊葡萄）是杜鹃花科熊果属的一种可药用植物，熊果酸是其主要活性成分，是一种具有多种生物学活性的五环三萜类化合物［16］。本课题组既往研究发现，熊果酸能够通过调节血脂、改善血流动力学指标、抑制主动脉病变等而对动脉粥样硬化大鼠起到保护作用［17-18］。王金艳等［19］研究发现，熊果酸具有抑制动脉粥样硬化大鼠氧化应激和炎症反应的作用，但对严重动脉粥样硬化导致急性心肌缺血并发症后是否具有保护作用尚未见文献报道。本研究采用冠状动脉左前降支下2 cm处结扎30 min的方法制备急性心肌I／R大鼠模型，并于术前7 d给予熊果酸进行预处理，以维拉帕米为阳性对照药物，维拉帕米能够通过抑制Ca2＋内流而减轻I／R损伤［20-21］，是临床上治疗心肌I／R损伤的常用药物。本研究结果显示，经熊果酸预处理能够有效抑制急性心肌I／R大鼠心电图ST段抬高、抑制心脏梗死体积增大、抑制心肌组织细胞形态结构病理性改变和损伤评分的升高，提示熊果酸预处理对急性心肌I／R损伤具有保护作用。

超声检测LVIDd、LVIDs以及FS、EF、SV指标能够及时、准确反映心脏组织功能状态。本研究结果显示，经熊果酸预处理能够有效抑制急性心肌I／R大鼠LVIDd、LVIDs升高和FS、EF、SV降低，提示熊果酸预处理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌损伤、保护其心功能的作用。

心肌I／R损伤病理机制非常复杂，张毅等［22］和王明娟等［23］研究发现氧化应激在I／R病理过程中发挥着重要作用。活性氧自由基（ROS）大量生成以及抗氧化酶过度消耗是导致氧化应激损伤的根本原因，ROS攻击不饱和脂肪酸而破坏细胞膜并损伤核酸、引发DNA断裂，MDA为脂质过氧化终产物，其含量与ROS数量成正相关，所以MDA也是评价氧化应激损伤的敏感指标［24-25］。熊果酸具有良好的抗氧化活性。本研究发现，经熊果酸预处理能够有效抑制急性心肌I／R大鼠心肌组织抗氧化酶（SOD、CAT）活力降低和MDA水平升高，提示熊果酸预处理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌组织氧化应激损伤的作用。

急性心肌I／R后因缺血缺氧而引发心肌组织释放粘附分子、激肽等炎性介质而导致炎症反应，诱导炎性细胞趋化并聚集于心肌组织梗死区，释放TNF-α、IL-6、ICAM-1等多种炎症因子，并进一步促进炎症反应，最终形成炎症级联反应［26-27］。心肌组织含有能够分泌TNF-α的巨噬细胞，而TNF-α在炎症反应的起始及整个过程均发挥着重要作用，并可诱导C反应蛋白合成，是引发炎症反应的重要因子［28-29］。IL-1β参与免疫细胞聚集，为炎症细胞因子生成创造条件［30］。本实验研究发现，经熊果酸预处理能够有效降低急性心肌I／R大鼠心肌组织TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6水平，提示熊果酸预处理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌组织炎症级联反应的作用。

综上所述，熊果酸预处理对急性心肌I／R损伤大鼠心功能和心肌组织损伤具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激损伤和炎症级联反应有关。