三种试剂对红细胞表面CD38抗原去除效果的研究

邵林楠 张树婷 王霓 周世航 于卫建

多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆性增殖的血液系统恶性肿瘤，发病率占血液系统肿瘤的10%左右[1]。在骨髓瘤细胞表面CD38抗原高表达，然而在红细胞、正常淋巴细胞和骨髓细胞上表达相对较弱，因此CD38分子已作为治疗MM的新靶点[2]。当MM患者通过抗-CD38单抗达雷妥尤（Daratumumab）治疗时，达雷妥尤单抗与红细胞表面CD38抗原结合，会造成患者血清（血浆）与几乎所有人红细胞间接抗人球蛋白试验（IAT）均弱阳性的结果[3]。CHAPUY等[3]使用0.2 mol/L二硫苏糖醇（DTT）破坏红细胞表面CD38抗原，从而使这种干扰现象得到缓解，而使用1%胰蛋白酶法得到的结果稍逊色于DTT法。此外CHAPUY等推测使用二巯基乙醇（2-ME）同样能达到缓解达雷妥尤带来的干扰[4]，但未经证实。由于我国实验室常用2-ME试剂，而且处理红细胞用的酶试剂多为菠萝蛋白酶及木瓜蛋白酶，胰蛋白酶相对使用较少[5]。因此结合国内实验室情况，本文我们参照CHAPUY等[3]报道的试剂浓度，研究了0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME及1%菠萝蛋白酶对红细胞表面CD38抗原去除的效果。

材料与方法

1 研究对象 血浆取自经达雷妥尤单抗治疗的MM患者（意外抗体筛查阳性，抗体特异性为IgM性质抗-Leb）；选取Leb抗原阴性的谱细胞及Leb抗原阴性的O型献血者红细胞各3份配成2%悬液。

2 试剂与仪器 抗人球蛋白试剂（抗IgG）购自上海血液生物医药公司；2-ME购自长春博德生物科技有限公司；抗-Leb购自CE-IMMUNDIAGNOSTIKA GmbH公司；抗-E购自上海血液生物医药公司；DTT购自美国Promega公司；菠萝蛋白酶购自美国Sigma公司；谱细胞购自Sanquin公司；KA-2200型离心机（日本久保田公司）；DK-600A型水浴箱（上海一恒仪器公司）。

3 试验方法 0.2 mol/L DTT配制方法参照CHAPUY[4]等。0.2 mol/L 2-ME和1%菠萝蛋白酶配制方法参照《输血技术学》[5]。红细胞处理方法参照文献[4]：上述溶液与红细胞悬液按照体积比4∶1混合，于37℃孵育30 min，生理盐水洗涤三次后配制成试验用红细胞悬液。同时采用未经处理的Leb抗原阴性的谱细胞及Leb抗原阴性的O型献血者红细胞悬液各3份作为对照。通常使用K+和E+红细胞作为巯基试剂处理的对照细胞，其中K抗原可被巯基试剂破坏，而E抗原不会被破坏[4]。由于无法获得抗-K血清，本实验中仅用E+红细胞作为对照。将红细胞悬液与含有达雷妥尤单抗的患者血浆进行间接抗球蛋白实验（IAT）[5]，来评估去除CD38抗原的效果。凝集判断标准参照《输血技术学》[5]。

结 果

1 DTT、2-ME及菠萝蛋白酶对红细胞表面E抗原处理结果 经0.2 mol/L DTT和0.2 mol/L 2-ME处理过的E+对照红细胞，使用直接离心法对红细胞表面E抗原进行检测，凝集强度仍为4+，与处理前凝集强度无差异。同样的，经过1%菠萝蛋白酶处理过的E+对照红细胞，E抗原也与处理前无差异（凝集强度4+）。

2 患者血浆与DTT、2-ME及菠萝蛋白酶处理后红细胞间接抗人球蛋白试验结果经0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME及1%菠萝蛋白酶处理过的红细胞与患者血浆进行IAT，结果见表1。

表1 患者血浆与备用红细胞悬液进行间接抗人球蛋白试验结果

由2-ME处理过的红细胞IAT结果均为阴性，DTT处理过的红细胞IAT结果1例献血者红细胞发生溶血，其余5例细胞结果均为阴性，而菠萝蛋白酶处理的红细胞进行IAT过程中有3例发生溶血现象，而余下3例IAT结果为显微镜下弱阳性。阳性对照结果为1+。

在进行IAT期间发现，经过DTT、2-ME及菠萝蛋白酶三种试剂处理过的红细胞均发生不同程度的溶血现象，最严重的为1%菠萝蛋白酶处理过的红细胞，6例红细胞中的3例发生完全溶血现象（见图1）。

图1 IAT实验过程中，三种试剂处理过的红细胞经过三次洗涤后剩余红细胞示意图

讨 论

2019年7月，用于治疗复发难治性M M的抗-CD38单克隆抗体达雷妥尤在我国批准上市。随着达雷妥尤单抗治疗的日益普及，输血实验室接收到此类患者血液标本的可能性也随之增加。由于达雷妥尤单抗对IAT产生泛凝集干扰，将为输血服务带来重大挑战。2016年美国血库协会（AABB）曾发布公告，介绍使用DTT处理红细胞表面CD38抗原进而消除干扰的方法。

DTT和2-ME是巯基还原剂，可以通过破坏红细胞胞外区的二硫键，进而使红细胞表面CD38抗原变性，阻止抗-CD38与红细胞结合[4]；而酶处理的作用是切割红细胞表面CD38抗原[6]。本文通过对比三种试剂对献血者新鲜红细胞、试剂红细胞表面CD38抗原的去除效果，发现三种试剂均能去除红细胞表面CD38抗原，献血者的新鲜红细胞和试剂红细胞之间区别不大。CHAPUY等[3]通过实验发现2%胰蛋白酶可将达雷妥尤与CD38抗原阳性HL-60细胞的结合率降低40%，而使用10 mmol/L DTT则可使结合率降低92%，说明DTT去除CD38抗原的效果要优于酶处理法，本文的试验结果与这一报道相一致。由于在实验过程中1%菠萝蛋白酶处理过的红细胞溶血最为严重，因此不建议使用菠萝蛋白酶试剂处理红细胞去除CD38抗原。目前国外通常采用0.2 mmol/L DTT处理红细胞来解决达雷妥尤的干扰，本文结果显示0.2 mmol/L DTT与0.2 mmol/L 2-ME去除红细胞表面CD38抗原效果基本一致，无DTT试剂时可以用2-ME替代。本文中三种试剂处理红细胞后，虽然红细胞表面CD38抗原得到破坏，但是同时使红细胞变得脆弱，相对于未经处理的红细胞更容易发生溶血现象。但溶血现象也与实验过程中操作有关，如洗涤时生理盐水对红细胞的冲击力过强、重悬红细胞时震荡过于猛烈等。如果使用微柱凝胶卡法，可以有效规避上述手工操作对处理红细胞造成的不良影响。

HUGAN等[7]报道0.2 mol/L DTT处理的谱细胞，在12 d内虽然会发生溶血现象但不影响检测性能，但溶血可能导致DTT处理的谱细胞数量减少。而LALLY等[8]研究发现，经DTT处理的筛选细胞，在9天内可检测到细胞表面具有临床意义的抗原（Kell除外），但对于某些同种抗体的反应强度却降低了一到两个等级。LORENZEN等[9]对DTT处理方法进行了改良，按照红细胞与0.2 mol/L DTT体积比为30∶25的比例处理红细胞，经处理红细胞与未经处理红细胞的溶血程度相同，而且可以保存33 d，此期间内反应强度没有下降。此外应该注意的是，DTT是有刺激性气味的有害物质，部分试验应该在通风柜下操作[5]。

DTT处理红细胞可解决达雷妥尤干扰，但是此类含巯基试剂处理存在一些不足：首先会对红细胞造成破坏，导致后续试验中红细胞更加容易溶血。其次在破坏CD38抗原的同时也会使Kell、Yt、JMH、Cartwright（Yta）、Scianna、Lutheran、LW、Cromer、Indian、Dombrock、Knops、Some Diego、MER2、Ge3等抗原变性或减弱[10]，在抗体鉴定、筛查或交叉配血试验中存在漏检抗体的风险。

本文的不足之处是只评估了三种试剂的一种工作浓度对红细胞表面CD38抗原的清除能力，这是因为受限于患者剩余血浆量。今后在条件允许的情况下，将会使用微柱凝胶卡法进一步评估三种试剂不同浓度对CD38抗原的处理效果。综上所述，三种试剂均能去除红细胞表面CD38抗原，但0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME去除效果优于1%菠萝蛋白酶，而且0.2 mol/L 2-ME可以作为0.2 mol/L DTT的替代品使用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突