抗-D免疫球蛋白预防RhD血型不合胎儿新生儿溶血病的研究进展*

范秀 肖军 李翠莹

RhD母婴血型不合新生儿溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）发生率仅次于ABO血型不合，但其病情重，并发症风险高，出生前易致流产、死胎、胎儿水肿等，出生后易并发重度贫血、高胆红素血症、胆红素脑病等，因此HDFN的预防愈显重要。预防HDFN的策略包括：尽量避免胎儿红细胞进入母体、降低母亲致敏机会、减少母体抗体的产生和对产生抗体者设法中和抗体、防止抗原抗体结合等。目前认为最有效的预防方法是使用抗-D免疫球蛋白（anti-D immune globulin，抗-D Ig）防止母亲致敏，现将其研究进展做一综述。

1 抗-D免疫球蛋白预防HDFN的机制 应用抗-D Ig预防抗-D抗体引起的HDFN效果显著，目前认为抗-D Ig预防HDFN的作用机制是抗体介导的免疫抑制机制（antibody-mediated immune suppression，AMIS）[1]。近一个世纪的研究中，基于不同机制的AMIS作用在不同的动物模型中不断被发现，其中与抗-D Ig相关的机制主要有以下几个方面。

1.1 红细胞清除：在免疫系统识别前，抗-D Ig即能促进单核吞噬系统（尤其是巨噬细胞）吞噬和清除母体循环中的来源于胎儿的RhD抗原阳性红细胞（RhD+红细胞）[2]。在红细胞表面结合的IgG与效应细胞表面IgG Fc段受体（FcγR）结合后引发吞噬作用中，抗-D Ig起到免疫调理作用（图1）。虽然IgG还可通过促进红细胞表面的补体激活，导致红细胞溶解或补体受体介导的吞噬作用加速红细胞清除，但抗-D Ig本身并不激活补体。这说明FcγR介导的吞噬作用可能是抗-D Ig引导的红细胞清除的主要机制[3]。

图1 抗-D Ig介导的RhD+红细胞清除作用

1.2 表位封闭/空间位阻：在绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠模型研究中有大量证据表明，表位封闭/空间位阻可能在介导AMIS作用中起主要作用[4,5]。表位封闭/空间位阻假说认为IgG掩蔽抗原表位从而阻止抗原被特异性B细胞受体（BCR）识别[6]。当使用抗-D Ig时，抗-D Ig与RhD+ RBC结合后，能有效抑制RhD+ RBC被特异性B细胞识别，从而抑制免疫引起的溶血反应（图2A）。

1.3 FcγRⅡB受体介导B细胞抑制：抗体Fc段受体（Fc gamma receptor，FcγR）属于免疫球蛋白超家族，是一类与免疫球蛋白Fc段结合的主要表达于白细胞表面的糖蛋白，在功能上分为活化性受体和抑制性受体两类。人类FcγR系统相对复杂，主要包括FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ三个亚群，每个亚群又可分为多种亚型，同时存在多个异构体。活化性FcγR受体种类较多，如FcγRⅠA、FcγRⅡA和FcγRⅢA，主要通过偶联含有免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）的γ二聚体传递激活信号，介导免疫反应。在人体内抑制性FcγR只有一种，即Fc段受体ⅡB（Fc gamma receptor ⅡB，FcγRIIB），FcγRⅡB通过自身分子胞浆区的免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）传递抑制信号。人类FcγRⅡB 存在两种主要异构体分子FcγRⅡB1和B2。FcγRⅡB1主要表达于B细胞表面，抑制B细胞激活、增殖、产生抗体；FcγRⅡB2主要由单核细胞和中性粒细胞表达，参与调节炎症反应，具有较强的吞噬复合物功能，并调控细胞因子释放。FcγRⅡB介导的B细胞抑制理论指出，抗-D Ig与红细胞抗原形成免疫复合物时，抗体Fc段与其B细胞表面的受体结合，其中抑制性受体FcγRⅡB1与BCR交联，该受体位于胞浆区的ITIM与BCR的ITAM近距离接触时，该复合物传递抑制信号，进而以抗原特异性的方式抑制B细胞激活、增殖和产生抗体（图2B）。

图2 其他抗-D Ig介导的免疫抑制机制

1.4 抗-D免疫球蛋白糖基化：抗-D Ig介导人红细胞的清除作用受FcγRⅢ多态性影响。除FcγRⅢ自身遗传变异外，抗-D Ig每个Cγ2区域谷氨酰胺（Asn）297位点的N-糖基化修饰水平对抗-D Ig与Fc段受体（FcγR）的相互作用产生影响。去除Fc段糖成分后，抗-D Ig与Fc段受体间相互作用被抑制，这同时与补体激活及抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）相关。抗-D Ig的多糖结构被认为在实现AMIS中发挥关键效能。由于抗-D Ig Fc段Asn297位点处的多糖仅能与FcγRⅢAsn162位点处的多糖产生相互作用，故抗-D Ig Fc段发生核心岩藻糖基化对抗-D Ig与FcγRⅢA和FcγRⅢB的结合有特异性影响，但对其他Fcγ受体无明显作用。由于无核心岩藻糖基化抗体与FcγRⅢA结合能力明显增强，故核心岩藻糖基化缺失显著促进IgG介导的ADCC作用。而抗-D Ig的Fc段核心岩藻糖基化水平已被证明与HDFN严重程度相关，岩藻糖基化水平越低HDFN越严重。因此，认识抗-D Ig的Fc段糖基化修饰水平对于确定HDFN严重程度及了解疾病的潜在机制是至关重要的[7，8]。

1.5 其他假说：除上述免疫学机制外还有其他一些假说试图解释抗-D Ig作用的机理，如免疫漂移、细胞因子效应及T细胞抑制等[9，10]。最近有证据表明，抗原调变可能是AMIS发生的另一机制，此反应不依赖于RBC清除，而是RBC表面抗原表位减少或丢失，使循环中的RBC持续呈抗原阴性，从而避免免疫系统识别和杀伤[1，11]。但该反应只在RBC表达单一外源性抗原的小鼠模型中被发现，尚不清楚RBC同时表达多个抗原时，抗原调变反应能否实现[12-14]。未来的研究仍需将重点放在进一步确定抗-D IgG相关的AMIS作用，并确保产生有效的治疗。

2 使用抗-D免疫球蛋白的临床指征 孕妇怀有RhD+胎儿是否产生抗-D抗体、是否发生HDFN, 首先取决于胎儿红细胞进入母体循环的时间、数量、概率，以及母体对胎儿红细胞的免疫反应性, 因此检测胎-母出血量是诊断、预防RhD HDFN的基础。妊娠过程中，胎儿红细胞通过胎盘进入母亲体内称为胎母出血（fetal-to-maternal hemorrhage，FMH）[15]。抗-D Ig预防的目的是减少胎母出血刺激母体产生抗-D抗体使母亲致敏的几率。凡是能引起胎儿红细胞进入母体的事件均需要进行抗-D Ig预防，包括产前致敏事件（如羊膜穿刺术、葡萄胎吸引术、宫内手术等）、RhD+胎儿分娩后、人工剥离、胎儿宫内死亡及产妇红细胞回收回输等。同时为避免怀有RhD抗原阴性（RhD－）胎儿的RhD－母亲进行不必要的抗-D Ig预防治疗，需对RhD－孕妇进行胎儿RHD基因的无创性产前检查（Non-invasive prenatal testing，NIPT），即检测孕妇外周血中的胎儿游离DNA （Cell-free fetal DNA，cff DNA）[16-18]。有研究表明引入胎儿RHD基因的无创性产前检查，仅对怀有RhD+胎儿的孕妇进行预防后，抗-D Ig的使用量减少约25.3%[19]、29%[20]。

3 抗-D免疫球蛋白的临床应用 抗-D Ig的应用经历了产后预防，产前出血预防及常规产前预防。未应用抗-D免疫球蛋白之前，怀有ABO血型与母体相容、RhD+的胎儿时，RhD－孕妇致敏产生抗-D的概率是16%；怀有ABO血型与母体不相容、RhD+的胎儿时，RhD－孕妇致敏产生抗-D的概率是2%；总体来看，怀有RhD+胎儿的RhD－孕妇致敏产生抗-D的概率是13.2%[21]。现最新《BCSH guideline for the use of anti-D immunoglobulin for the prevention of haemolytic disease of the fetus and newborn》（英国血液学标准委员会预防HDFN抗-D Ig应用指南）英国指南[22]：建议对孕龄＜12周的异位妊娠、葡萄胎、治疗性终止妊娠以及子宫反复出血、大量出血或伴有腹痛的出血的RhD－孕妇预防注射，注射剂量≥250 IU。对孕龄12～20周发生致敏事件的孕妇注射≥250 IU 抗-D Ig，均不需做FMH检测；孕龄20周后发生致敏事件后注射≥500 IU抗-D Ig，未致敏的RhD－孕妇发生了致敏事件均做FMH检测，必要时追加注射适量抗-D Ig[23]。

所有未致敏的RhD－孕妇均做常规产前抗-D预防（routine antenatal anti-D prophylaxis，RAADP）注射，采用28周的单剂量1500 IU方案或28周和34周的双剂量各500 IU方案均可；孕后期进行RAADP后，RhD－孕妇致敏产生抗-D的概率是0.37%[24]。婴儿出生后采集脐血做ABO和RhD血型鉴定，一旦证实婴儿为RhD+，所有此前未致敏的RhD－产妇均应在产后72 h内注射≥500 IU 抗-D Ig，产妇做FMH检测，并根据试验结果决定是否追加注射；产后72 h内应用合适剂量的抗-D Ig后，RhD－孕妇致敏产生抗-D的概率是1%～2% 。注射抗-D Ig时间为致敏事件发生＜72 h内，因故错过该时限，≤10 d内注射仍有一定的保护作用。500 IU剂量的标准抗-D Ig最高保护4 mL胎儿红细胞，1250 IU最高保护10 mL，1500 IU最高保护12 mL。按每1 mL胎儿红细胞给予125 IU的公式计算额外的抗-D免疫球蛋白剂量，将出生后已给予的抗-D Ig计算在内，为避免不同批次产品的免疫暴露，应选择和已使用标准剂量抗-D Ig统一批次的产品。

4 问题与展望 新生儿溶血病的发病机制通常与母婴血型不合相关，其中，Rh血型不合引起的新生儿症状最为严重，尤其是抗原性最强的D抗原，可引起严重的溶血反应。目前预防HDFN最有效的方式是产前、产后和常规使用抗-D Ig，能明显降低胎儿和新生儿溶血病的风险。如何有效评估胎儿是否存在发生HDFN的风险，并及时应用抗-D Ig预防治疗，是现阶段最需要注意的问题。胎儿血型产前基因诊断对HDFN的预防和治疗具有重要意义。但仍存在以下局限性：①国内外虽然在无创检测胎儿血型基因方面取得了一定进展，仍缺乏提取孕妇血浆中cff DNA的统一标准，cff DNA提取含量低导致检测假阴性，需通过同时检测内部对照物加以校正，如RHD阴性男胎的Y染色体基因序列（sry、dby和ttty2）和胎儿基因的短串联重复序列及低甲基化启动子序列等内部对照物已被有效地用于胎儿内部标记物；②不同种族之间的RHD基因存在异质性，国外适用的RHD基因的扩增方法不一定适合国人，需设计出符合我国人群血型基因的引物；③由于母体或胎儿遗传背景中存在无活性的假基因（RHDψ或杂交RHD-CE-D），检测结果可能会呈假阳性，避免携带RHDψ或杂交RHD-CE-D基因的个体出现假阳性结果，使用外显子4或5中的RHD特异性引物辨别RHDψ或杂交RHD-CE-D个体中的野生型RHD核苷酸序列和单核苷酸多态性（SNPs）[25]。针对RHD血型不合HDFN的诊疗关键是及早检查、及时确诊并使用抗-D Ig预防治疗。越早进行基因检测，越能有效预防HDFN的发生。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突