核桃楸提取物抑制人卵巢癌细胞HO-8910PM增殖的实验研究

李慕白，张明明，马红丽，侯丽辉

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，由于该肿瘤恶性程度高、组织类型复杂，且尚未找到有效的早期筛查方法，使3/4患者出现症状就医时已至晚期[1-3]。化疗虽是中晚期卵巢癌主要的治疗手段，但耐药现象致使卵巢癌患者生存期延长并不明显。因此开发出具有抗肿瘤活性、毒副作用小、无交叉耐药性的新型抗肿瘤药物，从而提高卵巢癌患者的生存率和生活质量，有着现实的研究意义[4]。中药作为一种低毒有效的抗肿瘤药物已经越来越被世人所关注。随着对疾病及植物药结构认识的不断深入，老药新用已成为一种趋势。核桃楸作为一种抗癌的民间中药，具有清热解毒、消肿止痛的功效，其树叶、树皮、外果皮及果实均有很大药用价值[5]。有学者对核桃楸叶、外果皮有效成分的提取及抗肿瘤作用进行了研究[6-9]，但对核桃楸皮的提取鉴定及体外抑瘤的实验研究尚少有报道。据此，本试验对核桃楸皮有效成分的提取及抗癌作用进行了研究，旨在为今后深入的研究工作奠定基础。

1 实验材料与方法

1.1细胞株 人卵巢癌细胞株H0-8910PM由中国科学院上海生物研究所细胞库提供。

1.2主要试剂及药物 核桃楸树皮，2018年7月采于黑龙江省苇河林场；DMEM高糖培养液购于Hyclone公司；小牛血清购于杭州四季青公司；PBS液、0.25%胰酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于AMRESCO公司；二甲基亚碱(DMSO)购于上海华舜公司；台盼蓝由重庆医科大学病理生理教研室提供。

1.3主要仪器及设备 核磁共振仪、熔点仪购于北京泰克仪器有限公司；紫外分析仪购于上海宝山顾村电光仪器厂；层析柱、层析用硅胶购于青岛海洋化工厂；薄层层析板购于烟台汇友硅胶开发有限公司；Hareus超净工作台(HFSafe1200型)和Hareus二氧化碳孵箱(BB5060型)均购于力新公司；OLYMPUS倒置相差显微镜(1*5058F2型)和Bio-RAO Model 550型自动酶联检测仪，日本制造；TDL-40B-C型台式高速离心机购于上海安亭科学仪器厂。

1.4核桃楸的有效成分提取 取2.0 kg核桃楸干树皮粉碎，用33 L无水乙醇浸泡4次，每次3 d。合并浸泡液过滤浓缩至500 mL左右，用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，制得相应的提取物。取乙酸乙酯提取物21.2 g，通过柱层析分离(柱径为6.0 cm，流动相：石油醚/乙酸乙酯=8/22 000 mL，5/51 500 mL，乙酸乙酯2 000 mL，乙酸乙酯/乙醇=8/22 000 mL，甲醇2 000 mL)得到6个部分(F1～F6)，将F1(34 g)经柱层析分离(柱径为4.5 cm，流动相:石油醚/乙酸乙酯=8/21 500 mL,5/51 500 mL，乙酸乙酯2 000 mL)得到化合物1和3。F4(2.7 g)经柱层析分离(柱径为3.0 cm，流动相:石油醚/乙酸乙酯=5/51 500 mL,乙酸乙酯2 000 mL)得到化合物6。F5(6.5 g)经柱层析分离(柱径为5.0 cm，流动相:氯仿/甲醇=8/23 000 mL，5/51 500 mL，甲醇2 000 mL)得化合物11，14和15。化合物1,3,6,11,14,15即核桃楸的有效成分Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6。

1.5细胞培养及分组 将卵巢癌细胞株HO-8910PM接种于含100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素、15%小牛血清的DMEM高糖培养液中,置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，隔天换液,培养至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化传代，台盼蓝拒染法计数活细胞数。调整细胞浓度为104个/mL，将细胞随机分为空白对照组、Y1组、Y2组、Y3组、Y4组、Y5组、Y6组，接种于96孔培养板中，200 μL/孔,37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。

1.6细胞形态学及MTT比色法观察 空白对照组不加药物，作为各药物各浓度水平的共同对照。Y1组：取核桃楸提取物，按10-8mg/mL、10-7mg/mL、10-6mg/mL、10-5mg/mL的浓度梯度稀释，每个浓度设8个孔。加入细胞孔后，分别培养24 h、48 h、72 h后，取出培养板,于显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化后，每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)37 ℃继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入20 μL DMSO,振荡10 min,使结晶物充分溶解。使用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定各孔光吸收值,记录结果,实验重复3次,然后计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值/对照组OD值)]×100%。其余5组观察方法同Y1组。

2 结 果

2.1核桃楸提取物的结构鉴定 Y1为棕色粉末，其谱图数据与文献[10]对照一致，故确定该化合物为a-羟基-四氢萘醌。Y2为黄色针状晶体，其谱图数据与文献[11]中胡桃醌数据完全一致，故鉴定为胡桃醌。Y3谱图数据与文献[12]对照一致，故确定该化合物的结构为4，8-二羟基萘酚-1-0-β-D-[6′-0-(3″，5″-二甲氧基-4″-羟基苯甲酰基)]葡萄糖苷。Y4为棕黄色粉，根据其图谱数据可确定该化合物为4，8-二羟基萘酚-β-D-(6′-乙酰氧基葡萄糖苷)。Y5为红棕色固体,数据与文献[13]一致，确定为4，8-二羟基萘酚-β-D-葡萄糖苷。Y6的碳谱数据与文献[13]报道一致，确定该化合物为4，5，8-二羟基-a-四氢萘醌-5-0-β-D-[6′-0-(4″-羟基-3″，5″-二甲氧基苯甲酰基)]葡萄糖苷。

2.2核桃楸提取物对卵巢癌细胞HO-8910PM的抑制作用 Y1、Y3、Y6组HO-8910PM细胞增殖抑制率有梯度变化，其他药物组细胞增殖抑制率无梯度变化。见表1。

表1 核桃楸6种提取物组卵巢癌细胞HO-8910PM的增殖抑制率 %

2.3核桃楸提取物对卵巢癌细胞HO-8910PM的时效与量效关系 Y1、Y3、Y6各4个浓度梯度分别作用于卵巢癌细胞HO-8910PM 24 h、48 h、72 h后，对肿瘤细胞增殖具有明显抑制作用，且抑制率随药物浓度的增高和作用时间的延长而增强，即呈剂量-效应和时间-效应依赖关系。见图1。

图1 核桃楸提取物Y1、Y3、Y6培养卵巢癌HO-8910PM细胞24 h、48 h、72 h后浓度-效应曲线

2.4核桃楸提取物对卵巢癌细胞HO-8910PM形态学影响 将HO-8910PM细胞培养24 h、48 h、72 h后与空白对照组相比，低倍镜下药物组的HO-8910PM细胞数量逐渐减少；高倍镜下药物组的HO-8910PM细胞贴壁能力下降，呈悬浮状态，细胞变小、变圆，胞浆浓缩，胞核深染，出现空泡变性，尤其是在作用72 h后，细胞出现大片脱落死亡。抑制作用最显著的10-5mg/mL核桃楸提取物Y6培养24 h、48 h、72 h后人卵巢癌细胞HO-8910PM形态见图2。

图2 10-5mg/mL核桃楸提取物Y6培养卵巢癌HO-8910PM细胞24 h、48 h、72 h后形态

3 讨 论

中医古籍中并无“卵巢癌”的病名记载，但根据其发病特点和临床症状，可归纳为“肠蕈”“癥瘕”“积聚”等范畴[14]。“癥瘕”最早记载于《素问·骨空论》，“任脉为病……女子带下癥聚”，并且认为其病位在奇经任脉[15]。《灵枢·水胀篇》以“石瘕”“肠覃”“壤肉”分别记述。中医认为:癥者，由寒温失节致脏腑元气虚弱，而食欲不消，聚结在内所致，或寒气客于肠外与卫气相搏而不去，始生肠蕈。根据中国历代医家对“癥瘕”的描述及中医学理论分析，外感邪毒、内伤饮食及情感抑郁为其致病因素，而脏腑阴阳气血失调，正气虚损则是致病基础，二者常互为因果，最终使痰、湿、气、血瘀滞于冲任、胞脉，久之则导致卵巢疾病的发生。因此，在临床上治疗以扶正固本、祛邪攻毒为主。

核桃楸为胡桃科胡桃属落叶乔木，别名胡桃楸、山核桃，主要分布于我国东北、华北等地区。其皮、叶、根、果实均可入药，具有清热解毒、止痢明目等功效[16]。近年来,诸多学者对核桃楸用药部位、有效成分进行了相关研究。曹治家等[17]的研究结果表明，从核桃楸皮中分离得到的木犀草素具有较明显的抑制肝癌细胞增殖的作用。Gao等[18]的实验表明，一种从核桃楸中提取的新型多不饱和脂肪酸JA限制了肝癌细胞的存活，从而诱导肝癌细胞凋亡。姜秀梅等[19]的实验研究结果发现山核桃楸的乙醇浸出物对子宫颈癌HeLa细胞有一定的抑制作用。上述研究表明核桃楸提取物能够抑制肿瘤细胞的增殖，而对于人卵巢癌细胞的增殖抑制作用目前鲜有报道，因而为了探讨核桃楸提取物对卵巢癌的作用机制，本实验观察了核桃楸提取物对卵巢癌细胞HO-8910PM分别作用24 h、48 h、72 h的抑瘤作用。结果表明，随着作用时间延长和药物浓度提高，核桃楸提取物Y1、Y3、Y6对HO-8910PM细胞的增殖抑制率显著提高，说明核桃楸提取物对卵巢癌HO-8910PM细胞的增殖具有抑制作用；其中短时间低浓度应用Y1、Y3对卵巢癌细胞抑制作用不明显，高浓度对细胞抑制作用较明显，提示Y1、Y3的浓度依赖性明显；而低剂量短时间应用Y6对卵巢癌细胞抑制作用明显，提示Y6的时间依赖性明显。

综上所述，核桃楸3种有效成分提取物α-羟基-四氢萘醌、4，8-二羟基萘酚-1-0-β-D-[6′-0-(3″，5″-二甲氧基-4″-羟基苯甲酰基)]葡萄糖苷和4，5，8-二羟基-ɑ-四氢萘醌-5-0-β-D-[6′-0-(4″-羟基-3″，5″-二甲氧基苯甲酰基)]葡萄糖苷可以通过促进卵巢癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖、增生以达到抗癌作用，为临床治疗卵巢癌提供了全新的思路和充分的理论依据。今后应进一步深入研究核桃楸促进卵巢癌细胞凋亡的具体分子机制以及信号通路，为核桃楸治疗卵巢癌的临床应用及推广奠定坚实的理论基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。