鉴别1家庭α地贫基因罕见突变及其家庭遗传分析

梁伟达 曾劲伟 薛家权 林粤 陈小龙

地中海贫血（简称地贫）是一种常染色体隐形遗传疾病，该病会导致患者血红蛋白（Hemoglobin，HB）表达异常［1］。α 地贫源于α 珠蛋白基因突变，在我国南方特别是广东广西两省携带者众多，广东人群的α 地贫基因携带率约为8.5%［2⁃3］，由于其发病率高，影响大［4］，目前我国把它作为一个产前筛查的常规项目。常规检测方法只能检测到常见的基因型，稀有基因型很容易漏诊［5］，给产前筛查带来挑战。本研究对一个家庭中α 地贫基因一种新型罕见突变进行鉴别，并对该家庭地贫基因进行遗传分析。

1 资料与方法

1.1 资料

先证者男性，27 岁，贫血貌，患者因备孕行地贫基因分型检测，使用PCR⁃反向点杂交法（Polymerase Chain Reaction⁃Reverse Dot Blot，PCR⁃RDB）［6］基因分型检测结果为⁃⁃SEA纯合子，与血常规和血红蛋白电泳表型不符。为明确其基因型及遗传特性，同时对其父亲和母亲地贫基因进行分析。

1.2 血红蛋白电泳

采用法国CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING全自动毛细管电泳仪进行分析，使用仪器配套的试剂严格按照标准操作规范完成实验。

1.3 PCR⁃RDB 法检测地贫基因分型

按照深圳亚能生物技术有限公司提供的试剂盒说明书进行操作。先提取DNA，然后对DNA 进行PCR 扩增，扩增条件：50℃15 min，96℃15 min，62℃50 s，72℃75 s，然后进入循环（97℃45 s，59℃50 s，72℃75 s）35 次，最后72℃延伸5 min。扩增产物滴在包被有基因突变特异性探针膜上进行杂交，观察检测膜条上各位点信号的有无，判断待检样品基因型。

1.4 α 地贫基因测序

使用Sanger 法测序，由深圳亚能生物技术有限公司提供基因测序服务。

1.5 统计与分析

地贫基因参考序列（NG_000006.1）下载自美国国立生物技术信息中心（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene），使用ClustalX2 对测序结果进行序列比对及突变分析。

2 结果

2.1 血常规及血红蛋白电泳结果

该家庭父亲和先证者的平均红细胞体积（Mean Corpusular Volume MCV）降低，红细胞数量（Red Blood Count RBC）代偿性增高，铁蛋白（Ferritin Fer）HB 正常，血红蛋白A2（Hemoglobin A2 HBA2）下降，有地贫表征，母亲各项指标正常。见表1。

表1 家庭成员红细胞常规数据及血红蛋白电泳结果Table 1 Routine data of red blood cells and Hemoglobin electrophoresis results of family members

2.2 地贫基因分型检测结果

该家庭父亲地贫基因型为⁃⁃SEA杂合型，母亲未发现中国人常见地贫基因突变，父亲和母亲地贫基因分型与表型相符。见图1。

2.3 地贫基因测序结果

图1 家庭成员地贫基因分型结果Figure 1 Genotyping results of thalassemia in family members

父亲地贫基因Sanger 测序结果显示出一条完整的α 序列，结合PCR⁃RDB 结果，判定父亲地贫基因型为⁃⁃SEA杂合型（见图2B）；母亲地贫基因型有两处罕见突变型，其中一处为IVS⁃II⁃55（T⁃＞G）纯合突变，即α2 基因第二个内含子第55 位由T 变成G，另一处为IVS⁃II⁃119（⁃G，+CTCGGCCC）杂合突变，即α2 基因第二个内含子第119 位由G变成CTCGGCCC（见图2C）；先证者地贫基因Sanger 测序结果显示出IVS⁃II⁃55（T⁃＞G）和IVS⁃II⁃119（⁃G，+CTCGGCCC）两处纯合突变，结合PCR⁃RDB 结果，先证者为罕见突变型杂合⁃⁃SEA型（见图2A）。该罕见突变型与参考序列的比对见图2D。

图2 家庭成员地贫基因测序结果Figure 2 Red box indicates mutation site，Black box indicates pre mutation site

2.4 家系遗传分析

通过上述测序和基因分型结果综合分析，先证者的罕见基因突变来自于母亲，而⁃⁃SEA地贫基因来自于父亲，从表征上看，该罕见基因突变没有对患者表型产生影响，但会导致常见地贫基因型检测结果的误判，影响产前筛查而导致错误的引产。

3 讨论

地中海贫血是一种常染色体隐形遗传疾病，变异种类繁多，目前宾夕法尼亚大学地贫数据库公开显示共有1 783 种突变类型（http：//globin.bx.psu.edu/cgi⁃bin/ hbvar/query_vars3），并且新的影响人类健康的突变类型也在不断发现中，如2012年报道的β 型CD27（GCC⁃GAC）突变［7］，2016年报道的α 型*92A＞G 突变［8］，由于其变异种类的复杂性以及不断新增的新型变异给人类健康造成很大影响，给产前筛查工作带来新的挑战［9］。

本文鉴别的这种罕见α 地贫基因突变在宾夕法尼亚大学地贫数据库以及美国国立生物技术信息中 心（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）中均未有记录，发生在IVS⁃II⁃55（T⁃＞G），该位点位于α2 地贫基因内含子II 的第55 个碱基，由T 变成G，还有一个突变发生在IVS⁃II⁃119（⁃G，+CTCGGCCC），该位点位于α2 地贫基因内含子II的第199 个碱基，缺失G 而被CTCGGCCC 序列取代。内含子突变不会影响最终蛋白翻译的结果，因为mRNA在成熟过程中会把内含子剪切掉，但是最新研究表明，内含子的突变可以导致非典型剪接位点的激活或剪接调控元件的改变，从而影响mRNA 剪切和蛋白翻译［10］。中国南方地区最常见的例子如β654型（dbSNPrs34451549），其突变发生在β 基因内含子II 的第654 个碱基，部分患者出现较明显的贫血症状。有些地贫患者虽没有明显的表征，但是药物代谢会发生变化，譬如磺胺类药物会导致某些地贫患者高铁血红蛋白血症［11］。本文发现的该型突变未出现明显的表型症状，但其血红蛋白的合成、修饰以及药物代谢可能与常人不同，需要进一步研究。2016年我国广西区报道过与本文相同的突变，其突变概率大约为0.184%［12］，而本文发现的病例在广东地区，其突变概率还有待进一步收集数据统计分析。由于该突变经常合并⁃⁃SEA型，结果使患者患有较严重的贫血，提示在产前筛查中应特别留意。

目前临床应用的地贫基因检测主要是采用商品化试剂盒，其检测范围有限，不能检测出所有地贫基因突变，广东地区很多医院使用深圳亚能生物技术有限公司的商品化试剂盒，只能检测出αCS、αQS、αWS共3 种α 基因点突变，⁃⁃SEA、⁃α3.7、⁃α4.2等主要3 种α 基因缺失型，以及β654、βE、41⁃42 等17 种β地贫，罕见或未知突变类型检测不出，造成漏检。因此在临床工作中，地贫基因诊断应基于表型与基因型相结合的原则，当受检者血液学表型与常规检测的地贫基因型不符时，可能存在罕见或未知突变，须进一步进行检测确认。临床产前诊断中更要注重对胎儿的结果判读，对于PCR⁃RDB 法测出的“纯合子”的结果必须要结合临床表形、家系分析、影像结果进行综合分析，以免造成过失引产。本文丰富了中国人罕见地贫的数据，为临床诊断、遗传咨询、产前筛查提供帮助。