低分子量透明质酸对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

金洁琪，光梦凯

（1.首都医科大学附属北京友谊医院 口腔科，北京 100050；2.中日友好医院 口腔医学中心，北京 100029）

慢性牙周炎是牙齿周围支持组织的常见病，且与各种系统性疾病如冠心病，糖尿病等密切相关甚至相互促进[1，2]，因此积极治疗牙周病非常有必要。目前牙周病的治疗主要在于菌斑控制[3]而对促进牙周再生上有所欠缺。低分子量透明质酸（hyaluronan，HA）有抗炎，促进组织再生的作用，在临床上应用广泛[4]，而其对慢性牙周炎的作用待研究。

1 材料和方法

1.1 材料

选择牙周组织中广泛存在的人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）：购入原代细胞（Lonza 公司）后分离培养，传代至第5、6代后用于本次实验。成骨诱导（osteogenic stimulation，OS）液由地塞米松、β-甘油磷酸盐、抗坏血酸等加入培养基配成，具体配方见表1。

表1 成骨诱导液配比

HA 来自HYALOSE 公司。选择分子量3～6Da的Nano HA 及分子量150kDa 的HA 进行实验，每次实验用浓度为20ng/ml[5，6]。

1.2 实验方法

共分为空白对照组、阳性对照组 （OS 组）、Nano HA（OS+Nano HA）组和150K HA（OS+150K HA）组。

hMSCs 细胞在37℃、5% CO2的恒温箱中培养，每周换液2 次。每周同一时间显微镜拍照进行细胞形态学观察。细胞增殖WST-1 检测：将hMSCs 均匀种在4 盒48 孔培养皿中，等待48h，细胞完全附着生长后，标记为起点，分别在第0d、7d、14d、21d进行细胞增殖。WST-1 试剂盒来自Roche 公司，加入培养皿30min 后，将细胞进行ELISA 测试。

rt-PCR： 将hMSCs 均匀种在6 孔培养皿中，等待48h，细胞完全附着生长后，标记为起点，分别在第0d、7d、14d、21d 刮取细胞，提取RNA，转化为cDNA 后，进行rt-PCR 试验。管家基因选用GAPDH （search LC，Heidelberg 公司）。检测标记物为早期成骨标记物碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）及末期成骨标记物骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）。

钙沉积定量检测： 将hMSCs 均匀种在T-25培养皿中，培养21d 后分离刮取细胞，使用QuantiChromTM钙沉积试剂盒，加入试剂后进行ELISA 测试。

1.3 统计学方法

应用Prism8.0 进行统计学分析。两两比较采用t 检验，组间比较采用one-way ANOVA。

2 结果

2.1 HA 成骨诱导及形态学观察

由图1 可见，空白对照组中hMSCs 呈梭形或多角形，集落状生长，随着培养时间的增加，集落逐渐融合，细胞均匀聚集分布（图A1～A3）。B 组为成骨诱导的阳性对照组，第7d 起hMSCs 多呈圆形或椭圆形，第21d 可见类似骨样圆形结构形成（B3 中箭头所指），并有少量黑色矿物质沉积。C组为Nano HA 实验组，细胞形态与B 组类似，第21d 时亦可观察到有类似骨样圆形结构形成，并有比B 组更多的黑色矿物质沉积 （C3 中箭头所指）。D 组为150K HA 实验组，hMSCs 与B 组类似，第14d 即有较C 组更明显的骨样组织形成（D2），第21d 时骨样圆形结构黑色矿物质沉积与C 组类似（D3）。

图1 hMSCs 培养7d、14d、21d 时镜下片（×4）

2.2 HA 刺激hMSCs 增殖

图2 示，实验初期各组细胞生长速度接近，第14d 时，各组细胞生长速度开始略有不同，但各组内并无统计学差异。第21d 时，Nano HA 组较空白对照组细胞增殖显著增快（P<0.01），较OS 组亦较快（P<0.01）。150K HA 组较空白对照组增速较快（P<0.01）。2 种分子量HA 对细胞增殖无统计学差异，OS 组与空白对照组间亦无统计学差异。

图2 hMSCs WST-1 细胞增殖实验

2.3 rt-PCR 中ALP、OCN 的表达

图3 示，ALP 在hMSCs 中的表达在 前7d 随着时间增加而增加，21d 时均有所下降。在实验的第3d、7d Nano HA 组比OS 组表达更多的ALP（均P<0.05）。第21d，Nano 和150k HA 组都比阳性对照组有更高的表达 （P<0.05，P<0.01）；150k比Nano HA 组显著增高（P<0.01）。空白对照组在每个时间点均比同期的其他实验组的ALP 表达要低。各组内第3d、7d 和21d 时ALP 的表达均有统计学差异（均P<0.01）。

图3 hMSCs rt-PCR 中ALP 的表达

图4 中OCN 表达可见与ALP 的表达类似，前7d 随着时间增加而增加，到21d 时均有所下降。第3d、7d Nano HA 组的OCN 表达显著高于OS 组（均P<0.01）。150k HA 组表达与阳性对照组无统计学差异。第3d、7d 和21d 时组内OCN 的表达均有统计学差异（均P<0.01）。

图4 hMSCs rt-PCR 中OCN 的表达

2.4 钙沉积实验结果

图5 示，21d 时HA 对hMSCs 成骨分化有促进作用，尤以Nano HA 为甚。

图5 hMSCs 钙沉积定量实验

HA 实验组钙沉积量均显著高于空白对照组（均P<0.01），提示HA 可刺激hMSCs 成骨的分化。2 种分子量的HA 均有显著的刺激成骨的作用，Nano HA 及150K HA 组的钙沉积量均显著高于阳性对照组（均P<0.01）。此外，Nano HA 对细胞成骨的刺激显著高于150K HA 组 （P<0.05）。钙沉积量按多少排序为：Nano 组＞150k 组＞OS组＞空白对照组。

3 讨论

HA 由于其低细胞毒性、低抗原性、低致敏性，临床上在美容、关节软骨、关节炎治疗等方面已经广泛临床应用[7，8]。高分子量HA 对大部分细胞有抑制增殖的作用[9]。而低分子量HA 则相反，其刺激细胞增殖，本实验结果亦验证了这一结果。在d21 时Nano HA 及150K HA 促 进hMSCs 增殖。ALP 是成骨分化早期的标志物，细胞内ALP表达增高表明成骨的增加[10]。本实验中2 种HA都能提高hMSCs 的ALP 的表达，150kDa HA 比Nano HA 要更强。唾液中的OCN 含量与牙周炎的严重程度不相关[11]，但却是成骨晚期的标记物[12]。本实验中150kDa HA 对OCN 似乎没有影响，而Nano HA 可以提高hMSCs 的OCN 表达。钙沉积实验中，成骨诱导及低分子量HA 的加入较空白对照组均能显著增加钙沉积物，尤其是Nano HA可以显著增加细胞中钙的含量。总之，低分子量HA 的加入可以刺激hMSCs 成骨方向的分化。

HA 可诱导受损组织中成纤维细胞和角质细胞分化以修复受损伤的组织[13]，还可以在炎症状态下激活组织免疫反应[14]，对于牙周炎这种慢性炎症应用前景广泛。此外HA 还可以诱导软骨及韧带的修复[15]。后期对于牙周再生起重要作用的hMSCs 成软骨及成纤维分化将进一步研究。