上海市普陀区白纹伊蚊抗性监测与机制探索

张石昊 徐 宏 夏斯伟 张 亮 张柳颖 周毅彬

(1.上海市普陀区疾病预防控制中心消毒病媒科，上海 200333；2.上海市疾病预防控制中心传染病防治所，上海 200336)

白纹伊蚊Aedesalbopictus是上海市唯一的登革热媒介蚊种(朱江等，2018)，由于全球旅游行业的发达，每年来自登革热疫区国家的输入性病例对于上海登革热疫情的防控有着不小的压力。登革热疫情的控制主要依赖于使用化学药物使环境成蚊密度快速降低(Bradyetal., 2020)，因此药物的选择以及蚊虫的抗药性会影响登革热疫情控制效果。根据上海市登革热应急处置工作方案，拟除虫菊酯类药物依然是登革热防控的主要杀虫剂。然而，监测显示(刘洪霞等，2020)上海市登革热媒介虫种白纹伊蚊已经对多种除虫菊酯类药物产生一定水平抗性，且随着时间推移呈显著上升趋势，此外，拟除虫菊酯与双硫磷、残杀威等杀虫剂存在的交互抗性(Yuntaetal., 2019)也对精准选择杀虫剂影响巨大。

蚊虫对于杀虫剂的抗性通常被认为来源于杀虫剂对于蚊虫种群的高度筛选，在这种长期的筛选压力下，抗性这一遗传性状在蚊虫种群中固定并保留(Liu, 2015)。抗性机制的产生主要包括(Nkyaetal.,2013)代谢抗性、靶点抗性、穿透力改变和行为抗性4类。对白纹伊蚊抗性的研究开展相对较晚，直到2003年泰国首次报道了白纹伊蚊对于有机氯杀虫剂DDT的高抗性(Somboonetal., 2003)，2011年首次报道了白纹伊蚊kdr基因上的有义突变(Kasaietal.,2011)，2015—2018年，我国也逐渐报道在F1534位点上发生不同突变的蚊虫种群，但在其他可能发生变异的位点报告较少(Xuetal., 2016; Lietal., 2018; Gaoetal., 2018)。家蝇中kdr基因已被确认为拟除虫菊酯类杀虫剂的目标靶点，但是不同位点突变对于不同种类除虫菊酯的抗性影响有着较大的差别(Yanetal., 2020)。

1 材料与方法

1.1 白纹伊蚊样本采集

白纹伊蚊幼虫和成虫样本于2019年采集自上海市普陀区5所不同的居民区，包括长风四村(CF)、真如西村(ZR)、新会苑(XH)、师大一村(SD)和东新路小区(DX)。DX从未开展化学措施处置蚊虫，ZR和XH每年均开展夏季蚊虫控制，使用菊酯类杀虫剂进行蚊虫密度控制。白纹伊蚊幼虫采自相应区域的不同孳生地，例如轮胎、花盘托盆、容器等。成虫则采用人诱法，使用吸蚊器吸取。将采集到的蚊虫带回上海市普陀区疾病预防控制中心进行饲养，饲养条件为(26±1)℃和RH 65%±5%，幼虫培养至成虫后繁殖一代，成虫则直接繁殖一代，F1代成虫用于药敏试验。

1.2 杀虫剂抗性测定

研究采用WHO推荐的接触筒法(WHO, 2016), 由于WHO对于白纹伊蚊的诊断剂量推荐不够确切，除其提供的部分诊断剂量以外，WHO建议可以依照敏感品系LC99的两倍浓度作为诊断剂量(WHO, 2016)，因此本研究根据中国疾病预防控制中心建议，参考文献(高景鹏，2018；Wangetal., 2017)的研究，诊断剂量选择残杀威(0.05%)、高效氯氰菊酯(0.4%)和氯菊酯(3%)。实验取羽化后3～5日龄未吸血雌性白纹伊蚊分别置于含残杀威(0.05%)、高效氯氰菊酯(0.4%)和氯菊酯(3%)标准药膜的接触筒中，每种药物设立4个实验组和3个空白对照组，药膜均由中国疾病预防控制中心提供。测试结束后，将活的蚊虫速冻致死，所有测试蚊虫置于95%乙醇之中，用于之后的DNA分析。

白纹伊蚊成虫抗性判定标准参照GB/T 26347—2010《蚊虫抗药性检测方法 生物测定法》：实验组成蚊死亡率≥98.0%为敏感种群; 80.0%～97.9%为可疑抗性种群; <80.0%为抗性种群。对照组死亡率<5%，无需校正; 死亡率5%～20%，实验组的死亡率以Abbott 公式进行校正; 死亡率>20%，则需重新测试。

1.3 酶活性测试

测试羧酸酯酶和P450S两种酶活性，选择F1代3～5日龄未吸血的雌性成虫。通过测定每个样品的平均吸光度，将测试蚊虫个体酶活性转化为基于该蚊虫个体提取出蛋白质总量的标化值。采用BCA法测定样品蛋白质总量，参照文献测定羧酸酯酶(Hosokawaetal., 2002)和P450S酶系(Brogdonetal., 1997)的活性。选取不同地区健康未吸血蚊虫雌虫各20只进行测定。参照BCA蛋白浓度试剂盒(北京Solrbio公司)说明测定，以牛血清白蛋白为标准对照，使用分光光度法进行测定，仪器为紫外/可见分光光度计(Cary50，美国Agilent公司)。

羧酸酯酶的活性以α-乙酸萘酯为底物进行测试，体系为300 μL酶液与300 μL α-乙酸萘酯溶液(14 mg α-乙酸萘酯：5 mL丙酮：20 mL PBS缓冲液),25 ℃水浴下反应15 min，加入300 μL 固蓝溶液(50 mg fast blue溶于50 mL PBS缓冲液)，然后25 ℃水浴放置5 min，测定595 nm下的吸光度，重复3次剔除异常值后取平均值。用α-乙酸萘酚作为校准酶活性的标准，测定其0～13 μg范围内的标准曲线。NSE的比活力采用nmol的α- NAPHTHOL/(min·mg pr)评价。

图1 接触筒法测定各地区白纹伊蚊对三种杀虫剂死亡率Fig. 1 The mortality of Aedes albopictus 5 fields populations using the WHO tube bioassayA. 残杀威；B.高效氯氰菊酯；C. 氯菊酯。虚线是80%死亡率，实线为98%死亡率，死亡率低于98%说明该地区蚊虫存在可能抗性，低于80%说明该地区蚊虫存在确切抗性。A. Propoxur; B. Beta-cypermethrin; C. Permethrin. Dotted line represents mosquitoes′mortality at 80%, black lines as 98%. 98% mortality rate was the threshold for suspected resistance, and 80% mortality rate was the threshold for confirmatory resistance.

P450S酶系的测定则以3,3-,5,5-甲基联苯胺盐酸盐(TMBZ)为底物模型，采用细胞色素C(cyt c美国sigma公司)为标化品进行了测定。体系为300 μL酶液，600 μL TMBZ溶液(2 mg TMBZ：1 mL甲醇：5 mL pH=5.0醋酸钠缓冲液)和25 μL 3% H2O2。室温中反应5 min后测定630 nm下的吸光度。以细胞色素C为标准品建立标准曲线，计算相应样品中的酶活力。酶活力单位为nmol cyt c/mg pr。

1.4 kdr基因突变测定

参照文献方法(Kasaietal., 2011)检测白纹伊蚊钠离子通道蛋白VGSC中处于结构域II、III和IV中的可能突变位点，包括S989、I1011、v1016、F1534、D1763等(Xuetal., 2016；Auterietal., 2018 )。提取接触筒抗性检测的白纹伊蚊的基因组DNA，依据基因组DNA提取试剂盒说明书(QIAamp DNA Mini KIT)进行操作，PCR扩增参照文献(Kasaietal. 2011)的方法对钠离子通道蛋白基因相应结构域片段进行扩增，引物序列为aegSCF20、aegSCR21、aegSCF7、aegSCR7、aegSCF6和aegSCR8，反应条件依照文献(高景鹏，2018)研究。PCR扩增产物通过1%的琼脂糖电泳凝胶进行复核，然后送上海伯杰生物科技有限公司进行纯化和测序，测序引物同样参照文献(Kasaietal. 2011)为aegSCR22，aegSCR8和albSCF8。使用MEGA v.5.2软件对所得序列进行分析。

2 结果

2.1 白纹伊蚊抗药性

研究测定了5处居民区白纹伊蚊对于残杀威(0.05%)、高效氯氰菊酯(0.4%)和氯菊酯(3%)的抗药性，死亡率如图1所示。其中白纹伊蚊对于残杀威(0.05%)的死亡率范围为89.87% (SD)～100.00%(CF,ZR,DX)，除SD和XH地区的白纹伊蚊为可疑抗性以外，其余3处均为敏感；对于高效氯氰菊酯的死亡率范围为40.32%(SD)～100.00%(DX)，除DX地区抗药性为敏感以外，其余4处白纹伊蚊均存在抗性;对于氯菊酯而言死亡率范围为70.33%(SD)～96.92%(CF),除SD地区以外，其余4处均为可疑抗性。三种杀虫剂中，高效氯氰菊酯的平均死亡率最低。SD地区采集的蚊虫种群对于3种杀虫剂的死亡率在5个地区中均最低，而DX地区的白纹伊蚊对于测试药物几乎不存在抗药性。

2.2 白纹伊蚊酶活性

5处居民区白纹伊蚊的羧酸酯酶活性如图2所示，DX地区白纹伊蚊的羧酸酯酶活性低于其余4处(PMAX=0.001)，XH地区活性则显著高于其他4处(PMAX=0.029)，其余3处地区间羧酸酯酶活性差异无统计学意义(PMIN=0.385)。5处居民区白纹伊蚊MFOS活性，SD地区最高，且高于DX(P<0.001)、CF(P<0.001)和ZR(P=0.033)，DX地区同样是所有地区中酶活性最低的地区并仅与ZR地区差异无统计学意义(P=0.249)。

图2 普陀区5个地区白纹伊蚊雌蚊酶活性水平Fig. 2 Enzymes activity of detoxification enzymes and no-specific esterase in adult Aedes albopictus from Putuo, ShanghaiA.非特异性酯酶；B. 单氧化酶。每个条形图由该地区蚊虫酶活性的均数及95%CI构成，*代表与对照组(DX)差异有统计学意义。A. No-specific esterase; B. Detoxification enzymes. Error bar is the standard error of the mean. An asterisk (*) indicates a significant difference between the population and the control population (DX) at P < 0.05.

由于除SD地区外，所有种群对残杀威的抗性无明显差别，故将其他4处数据合并，结果显示SD地区蚊虫抗性(P<0.001)、MFOs酶活性(P=0.001)与其余地区有统计学意义，NSE酶活性差异无统计学意义(P=0.466)，提示对于SD地区蚊虫的残杀威抗性更高可能与其MFOS酶活性呈正相关。而对于高效氯氰菊酯，4处抗性均高于DX地区的白纹伊蚊，同时NSE酶活性和除ZR地区以外的MFOs酶活性亦均高于DX地区，提示CF、SD、XH地区高效氯氰菊酯的相对高抗可能是由两种酶活性升高的共同作用产生，而ZR地区的相对高抗性则可能仅由NSE酶活性升高引起。SD地区和ZR地区的白纹伊蚊对氯菊酯的抗性显著高于包括DX在内的其余3处，但这两个地区的NSE酶活性与除了DX外的其他地区无显著差异，意味着NSE酶活性可能并不是导致这些地区氯菊酯抗性差异的原因。SD地区的MFOs酶活性显著高于除XH外其他地区，提示MFOs酶活性水平升高可能是引起SD地区氯菊酯高抗性的主要因素。

整体而言，DX地区两种酶活性最低，而SD地区MFOs酶活性最高的，这可能使得该地区对菊酯类杀虫剂抗性更加的明显，而这种高水平的酶活性可能也对其残杀威的抗性产生了一定影响。ZR地区则是唯一MFOs酶活性没有高于DX的地区，然而它对于菊酯类的抗药性却依然更高。其余2处CF和ZR对于残杀威的抗性与DX地区持平，对于菊酯类药物的抗性处则于中间水平，NSE和MFOs酶活性亦均高于DX地区，即这两个地区对于菊酯类的抗性的升高可能由两种酶活性水平升高共同影响，同时这并未引起这两个地区蚊虫对于残杀威抗性的增加。

2.3 kdr基因突变频率

通过一代测序检测了5个种群的白纹伊蚊VGSC基因中结构域II、III、 IV上的部分序列，仅I1532和F1534两个位点检测到有义突变。在发现突变的两个位点上，各发现一种突变型，即I1532 T和F1534 S，这两种突变等位基因在5个种群中均有发现，频率如表1和表2所示。其中I1532检测出频率较少，且仅有野生型纯合子I/I和突变型纯合子T/T两种基因型，实验组与对照组相比,突变型等位基因频率差异无统计学意义。F1534 S在所有5个蚊虫种群中广泛存在，其中最高的SD地区频率高达82.8%,同时所有种群的蚊虫均存在3种基因型，包括野生型纯合子F/F,突变型纯合子S/S以及杂合子F/S，杂合子的比例在ZR和DX地区中相对较高。其余3个地区蚊虫突变纯合子比例较高，同时SD地区蚊虫的突变型等位基因频率高于DX地区(P=0.027)和ZR(P=0.023)地区，这也可能是造成SD地区对于菊酯类杀虫剂高度抗性的原因之一。

表1 上海市普陀区5个地区白纹伊蚊 I1532位点突变情况Tab.1 Mutations frequency at codon I1532 in Aedes albopictus populations from Putuo District, Shanghai

表2 上海市普陀区5个地区白纹伊蚊 F1534位点突变情况Tab.2 Mutations frequency at codon F1534 in Aedes albopictus populations from Putuo District, Shanghai

3 讨论

在登革热疫情处置中，化学控制依旧是重要手段。历年监测数据显示普陀区的蚊虫已经对多种杀虫剂产生了抗药性(刘洪霞等，2020)，但在2015年之前抗性监测的目标为淡色库蚊，由于淡色库蚊与白纹伊蚊在抗性机制上有一定差别(Somboonetal., 2003; Pocquetetal., 2014; Liuetal., 2015)，例如，淡色库蚊kdr基因上的有义突变位点较白纹伊蚊更多，酶活性的均值与白纹伊蚊有较大差异，新时期的抗性水平难以与旧时期的进行比较。与此同时白纹伊蚊幼虫的抗性并不能直接等同于成虫的抗性，一项古巴的研究发现(Bissetetal., 2014)，成虫与幼虫在双硫磷、残杀威等药物的抗性水平上有着明确差异，因此成虫的抗药性更能有效指导实际病媒控制工作。

除DX外所有地区均存在不同水平的菊酯类抗性，这意味着长期用药已使普陀区大部分白纹伊蚊种群对菊酯类药物产生抗性，这些蚊虫种群中F1534位点普遍发现的高频率抗性突变也证实了这一点，这提示了普陀区白纹伊蚊对于菊酯类广泛地抗性已经通过遗传固定下来，并有通过交通等多种方式扩散至非抗性地区的风险。对残杀威的抗药性，仅在SD地区的存在，这可能与该类杀虫剂的应用背景有关。对于普陀居民区的化学处置主要使用菊酯类药物而极少使用含有残杀威的杀虫剂，因而，大部分居民区的蚊虫种群对残杀威并不敏感，但是含有残杀威的复配杀虫剂会广泛地应用于蜚蠊、蝇类的灭杀，因此这类杀虫剂常使用于农贸集市、火车站、公共绿地等公共场所的滞留喷洒当中，SD地区与华东师范大学中北校区相邻，校区内有大片公共绿地，因此SD地区较高的残杀威抗性，可能与该地区的用药种类及频次有关。本研究蚊虫采集地区由于仅包含居民区，非居民区的白纹伊蚊对于残杀威的抗药性还有待评价。

影响蚊虫抗性的主要机制包括靶点的改变、酶活性的变化、表皮穿透性改变和行为因素，酶活性同样也是导致普陀区不同地区蚊虫种群抗性差异的重要因素。其中NSE已被发现与有机磷类杀虫剂的抗性相关(Floresetal., 2006)，MFOs则主要被认为与菊酯类杀虫剂抗性的产生有关(Amelia-Yapetal., 2019)，但是这两类解毒酶由于其广谱解毒效果，偶尔也被发现与其他杀虫剂的抗性存在一定联系(Limaetal., 2011)，残杀威抗性通常认为与乙酰胆碱酯酶(AchE)间有重要联系(Bissetetal., 2006)。本研究中，DX地区白纹伊蚊种群的NSE与MFOs酶活性均最低，这也与其较低的抗性水平相匹配。SD地区MFOs酶活性水平最高，也有着同样最高的菊酯类杀虫剂抗性水平，同时SD地区的F1534位点的突变型频率也显著高于对照组，因此，其对菊酯类杀虫剂的抗性水平高于其他地区。F1534 S的表型在许多研究中被认为会引起I型拟除虫菊酯抗性而对II型拟除虫菊酯影响较小(Yanetal., 2020)，这意味着SD地区对于高效氯氰菊酯的抗性可能更多地由MFOs的高活性引起。SD地区的NSE水平仅高于DX地区，可以推测SD地区白纹伊蚊的有机磷类杀虫剂的抗性水平较低，由于该地区同时对残杀威和菊酯类杀虫剂高度抗性，在后续的疫情处置中有机磷类和Ⅰ型除虫菊酯类杀虫剂将是更好的选择。另一个角度来说，由于NSE酶活性普遍高于DX地区，而对应的菊酯类抗性水平与之类似，可以推测NSE酶活性也在有某些情况下可能会有限地影响蚊虫菊酯类杀虫剂的抗性。ZR地区的白纹伊蚊种群MFOs酶活性是唯一没有高于对照组的地区，然而其对菊酯类的抗性在所有地区中却仅次于SD地区，同时，kdr基因在F1534位点的突变水平也与其他地区无显著差异，这提示其他因素也可能引起菊酯类抗性。例如在一些研究中(Gaoetal. 2018)，I1532位点的突变与菊酯类杀虫剂抗性相关，而ZR地区该位点的突变频率略高于其他地区。CF地区和XH地区的酶活性与抗性水平均处于中游，对Ⅱ型除虫菊酯高效氯氰菊酯具有确定抗性，而对Ⅰ型除虫菊酯—氯菊酯仅存在可疑抗性，因此，在杀虫剂的选择上可以考虑Ⅰ型除虫菊酯或其复配剂，包括高氯残杀威，烯丙菊酯，胺氯菊酯等。但是由于Ⅰ、Ⅱ型除虫菊酯均会引起MFOs活性的升高，即存在一定的交叉抗性，用药时亦需同时对这两类杀虫剂进行抗性监测。