不同气候区白纹伊蚊滞育卵差异研究*

张强辉 姜玉庭 李超杰 赵 腾 张恒端 邢 丹 董言德 李春晓 赵彤言 郭晓霞

(军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室,媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重点实验室，北京 100071)

白纹伊蚊Aedes albopictus是多种虫媒传染病如登革热、寨卡病毒病等的传播媒介。白纹伊蚊广泛分布于我国亚热带和温带地区，根据气候差异，亚热带地区又分为南亚热带、中亚热带和北亚热带3个气候区(Bonizzonietal., 2013)。白纹伊蚊滞育卵或离水干燥的卵是白纹伊蚊度过寒冷冬季和旱季的主要虫态。位于不同气候区的白纹伊蚊地理株对滞育诱导因素的反应以及滞育发生的强度不同，其代谢活动和卵内发生的生理、生化反应也受到不同程度的抑制(Denlingeretal., 2014)。南亚热带地区为常绿阔叶林气候，最冷月平均气温在10～15 ℃，白纹伊蚊长期处于日照长短变化和温度变化幅度很小的地理环境，滞育卵只需低氧水的刺激便可孵化；而北亚热带地区为典型季风落叶气候，最冷月平均气温低至0 ℃(焦北辰,1984)，冬季短光照、低温对亲代和卵的联合作用，使白纹伊蚊滞育卵需经过长光照诱导和低氧水的刺激，打破滞育，才能遇水孵化(杨振洲,1988)。本研究主要通过模拟短光照周期诱导位于不同气候区的白纹伊蚊滞育卵的生存情况和滞育状况，探索位于我国不同气候区的3株白纹伊蚊滞育卵生存和分布特点，了解白纹伊蚊滞育卵实现入侵和定殖的生物学基础，为探索新型蚊媒防治手段提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 白纹伊蚊实验室养殖

实验所用白纹伊蚊分别为北京株(地理坐标：N39°51′, E116°17′)、杭州株(地理坐标：N30°16′, E120°12′)和广州株(地理坐标：N23°07′, E113°16′)，均于2019年野外采集后，带回实验室饲养传代五次。养殖室条件为(27±1)℃，(70±10)%相对湿度，光照周期为L∶D=14 h∶10 h。成蚊饲养在25 cm×25 cm×25 cm的蚊笼中，用8%的糖水喂饲。

1.2 实验设计

在养殖室内，短光照诱导白纹伊蚊产滞育卵，光周期诱导从幼虫期开始。实验组蚊虫在光周期L∶D=8 h∶16 h条件下养殖的为短光周期诱导组，在二龄幼虫期间接受短光周期诱导至实验结束。对照组蚊虫在光周期L∶D=16 h∶8 h条件下养殖，每组养殖4笼蚊虫(200/笼)，成蚊用8%的糖水饲养喂饲。

1.3 卵的保存

短光照组和对照组雌蚊在吸食昆明小鼠血液后，滤纸浸湿后放入卵杯供蚊虫产卵。4 d后取出卵纸，空气干燥，放入盛有饱和盐溶液的卵缸内使胚胎发育完全后，保存于对应光周期的光照培养箱内。保存对照组的卵的光照培养箱条件为：光周期L∶D=16 h∶8 h，恒定相对湿度为90%，温度为10 ℃。短光照组的卵置于光照培养箱的条件为：L∶D=8 h∶16 h，恒定相对湿度为90%，温度为0 ℃，以此模拟冬季野外环境气候。

1.4 白纹伊蚊滞育卵的发育情况变化

本研究基于模拟冬季野外气温条件保存卵的实验处置，对处于不同发育时期的白纹伊蚊滞育卵设置时间节点，观察不同产卵后天数(days post-oviposition, dpov)的白纹伊蚊卵发育情况的变化，可分为3 dpov，胚胎发育期产卵后7 dpov，滞育前期产卵后11 dpov，滞育中期产卵后21 dpov，滞育后期产卵后40 dpov。通过在显微镜下观察卵的状态鉴定存活情况，破碎、干瘪的卵为不能孵化的胚胎。发育完全的白纹伊蚊卵胚:胚胎占满整个卵,胚带延伸,节间沟加深，节间沟延伸到背部,三胸段已经融合,可见腹节;腕节明显。

1.5 白纹伊蚊滞育卵的判断及滞育率计算

取上述不同时间点的蚊卵，观察白纹伊蚊滞育率的变化，采用food slurry方法进行孵化(Poelchauetal., 2014)。500 mL自来水中加入500 mg幼虫饲料在养虫室内发酵24 h,用低氧水刺激滞育卵孵化,并在孵化过程中不断搅动给以刺激。抽取约300个卵孵化24 h后将卵纸取出，放置于对应光周期的培养箱中，7 d后进行第2次孵化，计出两次孵化出的幼虫数，将卵纸取出并在显微镜下记录破壳数。孵化率(%)=孵化的幼虫数/孵化的卵总数×100%。

未孵化的完整卵用漂白液(Trpiš, 1970)进行漂白(配方为次氯酸120 mL，冰醋酸80 mL加入去离子水定容至1 L，常温避光储存)，在显微镜下观察拍摄。滞育卵的判断标准：漂白后，滞育卵在反射光下通体呈现乳白色，卵胚发育完整，腹节分明，头部有红色眼点，头部孵化刺骨化呈黄褐色。滞育率的计算按照以下公式：滞育率(%)=未孵化卵胚完整的卵数/(孵化的幼虫数+未孵化卵胚完整的卵数)×100%。

1.6 统计学分析

所有数据采用R 3.6.3软件进行分析。不同组的滞育率和孵化率比较采用卡方检验或者Fisher精确概率法。P值经过Bonferroni校正并且P<0.05被认为有统计学意义。作图采用GraphPad Prism 8.0软件。

2 结果

2.1 短光照可诱导白纹伊蚊产滞育卵

卵的不同生存状态如图1所示。A图为完整可发育的卵胚，卵胚完整且胚胎占满整个卵，经过漂白后胚带延伸,节间沟加深,胚胎完全脱离卵壳，胸段已经融合,可见腹节且腕节明显；B图为干瘪的卵，被认为是不能孵化的胚胎；C图为滞育卵，此时卵胚通体呈现乳白色，卵胚发育完整，腹节分明，头部有红色眼点，头部孵化刺骨化呈黄褐色。

图1 不同形态的卵Fig.1 Different states of egg of Ae.albopictusA. 完整可孵化的卵胚；B.不能发育的卵；C. 滞育卵. A. Hatchable egg embryo; B. Undevelopable egg; C. Diapause egg.

2.2 光周期对不同地理株白纹伊蚊卵滞育率的影响

如图2所示，基于模拟冬季野外气温条件保存卵，在短光照下，3个不同地理株白纹伊蚊卵的滞育率从7～21 dpov逐渐上升,趋于平缓至40 dpov并达到最高。同一地理株白纹伊蚊卵的滞育率在不同滞育阶段有明显差异；3个地理株北京株、杭州株和广州株白纹伊蚊卵的滞育率在滞育前期11 dpov和滞育后期40 dpov统计学上差异显著(χ2= 87.721，P<0.01;χ2= 27.449，P<0.01;χ2= 11.551，P<0.01)。如图3所示，3个不同地理株白纹伊蚊滞育卵的滞育率在相同滞育阶段也有明显差异；在滞育前期11 dpov，滞育中期21 dpov和滞育后期40 dpov，北京株白纹伊蚊滞育率相比广州株白纹伊蚊滞育率统计学上有明显差异(χ2= 4.582，P<0.05;χ2= 11.520，P<0.01;χ2= 34.688，P<0.01)。杭州株和广州株白纹伊蚊滞育率在滞育中期21 dpov和滞育后期40 dpov的统计学上有显著差异(χ2= 11.520，P<0.01;χ2= 7.344，P<0.01)，但杭州株和广州株白纹伊蚊滞育率在滞育前期11 dpov的统计学上没有显著差异(χ2= 0.642，P>0.05)。

图2 在短光周期下不同地理株白纹伊蚊的卵在不同时期的滞育率Fig.2 Diapause incidences of Aedes albopictus from different geographic strains in various periods under short-day photoperiodBJ：北京株白纹伊蚊；HZ：杭州株白纹伊蚊；GZ：广州株白纹伊蚊.BJ：Ae. albopictus from Beijing; HZ：Ae. albopictus from Hangzhou; GZ：Ae. albopictus from Guangzhou.

图3 在短光周期下不同地理株白纹伊蚊卵的滞育率Fig.3 Diapause incidences of Ae. albopictus from different geographic strains on 11, 21, 40 days post-oviposition under short-day photoperiod

2.3 不同地理株白纹伊蚊滞育卵孵化情况

如表1～3所示，观察长光照对照组和短光照组中3个地理株在每个时间点的卵的孵化率动态变化。产卵后7 d孵化率相对较高，随着低温和光周期和联合作用，自第7～40 d后观察结束,孵化率逐渐降低至低点。长光照对照组中3个地理株白纹伊蚊卵在滞育中期21 dpov和滞育后期40 dpov的孵化率无统计学意义(χ2= 3.402，P>0.05；χ2= 1.640，P>0.05；χ2= 2.532，P>0.05)；对于不同地理株，在长光照光周期下亚热带地区杭州株和广州株白纹伊蚊卵滞育后期的孵化率相比于北京株白纹伊蚊卵孵化率统计学上无意义(χ2= 1.280，P>0.05；χ2= 0.320，P>0.05)。短光照组中3个地理株北京株、杭州株和广州株白纹伊蚊卵的孵化率在滞育前期11 dpov和滞育后期40 dpov分别有显著差异(χ2= 8.858，P<0.01; χ2= 97.750，P<0.01; χ2= 89.914，P<0.01)；对不同光周期比较发现，滞育中后期产卵后第21 dpov后，3个地理株白纹伊蚊在短光照组的卵的孵化率比长光照对照组的卵的孵化率低得多。对比不同地理株时，短光照下40 dpov时北京株白纹伊蚊的卵孵化率(21.45%)明显比广州株白纹伊蚊卵孵化率(8.15%)高(χ2= 20.117，P<0.01)。

表1 在不同光周期下北京株白纹伊蚊卵的孵化结果Tab.1 Egg hatch of Ae. albopictus from Beijing under different photoperiods

3 讨论

滞育可使昆虫度过不良环境和维持种群的发育，以维护昆虫种群的繁衍生息。在白纹伊蚊的滞育反应中，对光敏感的白纹伊蚊蛹或成年雌蚊能感知短日照的信号随后产生后代后，其幼虫进入卵的绒毛膜内而滞育。滞育赋予白纹伊蚊较强的抗逆能力，与非滞育卵相比，白纹伊蚊的滞育卵对低温(Hanson,1994)和干燥都有更强的抵抗力(Urbanskietal., 2010)。这些改变不仅有利于增加白纹伊蚊越冬存活率，更有利于经长途运输而实现全球大范围迅速入侵新领地，进而发展成为优势蚊种(Monteiroetal., 2007)。1985年在美国发现的第1个已知白纹伊蚊种群，究其本源可能是处于休眠状态的白纹伊蚊卵通过汽车轮胎传入(Hawleyetal., 1987)。对美国加州2001、2011年的白纹伊蚊种群进行基因溯源分析(Zhongetal., 2013)，发现当地白纹伊蚊的来源种群有亚洲亚热带和温带地区的中国广州株、厦门株白纹伊蚊。这些都表明探索阻遏白纹伊蚊滞育行为的新型蚊媒控制途径的迫切性。

表2 在不同光周期下杭州株白纹伊蚊卵的孵化结果Tab.2 Egg hatch of Ae. albopictus from Hangzhou under different photoperiods

表3 在不同光周期下广州株白纹伊蚊卵的孵化结果Tab.3 Egg hatch of Ae.albopictus from Guangzhou under different photoperiods

光周期是指自然日照时长，呈稳定的年周期性递变的现象，是自然界中包括昆虫在内的大多数温带动物预测季节变化的主要信号(Meutietal., 2013)。温带气候的月平均日照时长短,白纹伊蚊温带株呈现的滞育诱导易对光周期敏感。虽然不同地理株白纹伊蚊会呈现一定的异质性,但亚热带和温带白纹伊蚊品系皆具有滞育性。白纹伊蚊不同品系之间在短光周期(L∶D=8 h∶16 h)处理后滞育卵发生率在一个较大范围内波动,可能与白纹伊蚊营养状况或不同地理株品系相关。对我国2个地理品系白纹伊蚊进行亲代光周期诱导滞育卵的观察发现(杨振洲,1988)，白纹伊蚊温带宜兴品系(约北纬31° N)在光周期为以L∶D=8 h∶16 h可诱导卵期发生滞育；海南岛白纹伊蚊热带品系(约北纬18° N)，短光周期的变化不能诱导卵期滞育；而温带宜兴品系卵滞育率随亲代光周期缩短而增高的现象只发生在—定范围内(约9～15 h光照)。本研究的3个地理株分布位于温带地区的北京株和亚热带地区的杭州株和广州株白纹伊蚊均能在短光周期条件(湿度(70±10)%、光周期L∶D=8 h∶16 h)诱导后产下滞育卵。实验室长期饲养北京地区白纹伊蚊滞育卵发生率在90%以上。Poelchau等(2013)利用短光周期(L∶D=8 h∶16 h)处理白纹伊蚊美国弗吉尼亚州实验室株的卵滞育率在87.5%～100%之间。本实验中分布于北京39.9°N，杭州30.3°N,广州23.1°N野外采集的白纹伊蚊在短光周期诱导下滞育卵发生率也存在明显差异，温带品系北京地理种群滞育率在40 dpov为90%以上，而亚热带的杭州株和广州株白纹伊蚊地理种群滞育卵发生率明显较低。这也说明了亚热带、温带地区白纹伊蚊品系的光周期诱导滞育行为的存在较热带株地区白纹伊蚊品系具有更强的抗不良环境抵抗能力，亦或因温带地区地理气候冬季低温的影响，温带品系较热带品系的滞育深度更深且滞育历期更长。在40 dpov时，北京品系滞育率仍在上扬，尚未达到平台期，而杭州和广州品系在21 dpov后基本趋势呈现平缓，因而，温带和热带地理品系滞育历期不同，其发生机制需进一步探索。

亚热带和温带品系白纹伊蚊对短光周期敏感，短光周期下易滞育，但孵化率低 (Hawleyetal., 1987 , Urbanskietal., 2012)。本研究中不同地理株白纹伊蚊在长光周期处理的卵的孵化率明显高于短光周期的卵孵化率，广州株白纹伊蚊在对照组长光照下40 dpov的卵孵化率甚至高于50%，而在短光照周期下低于10%。说明亲代白纹伊蚊接受短光期的卵,孵化率明显下降,同时短光期下相对低温使卵的滞育程度进一步加深。研究表明，影响滞育的主要环境因素是光周期和温度 (Danks, 2004)。对位于美国北纬14° N的白纹伊蚊在21 ℃、26 ℃和29 ℃条件下进行诱导滞育研究，发现29 ℃时滞育发生率较低甚至无法诱导滞育，而温度较低的21 ℃和26 ℃可诱导滞育(Pumpunietal., 1992)。由此可见，温度与光周期对白纹伊蚊滞育是联合作用，但二者的相互作用关系仍不清楚。同时，影响滞育的因素不仅多而且内外因子相互作用关系错综复杂，大多数对其研究主要是光周期和温度，其他如湿度等方面研究有待加强。本研究中位于温带地区的白纹伊蚊品系滞育程度较深,可能与卵的低温保存有一定关系。因此，位于不同气候区的白纹伊蚊可能会因冬季的环境温度不同导致其越冬能力不同。同时全球气候变暖，加之滞育卵越冬形式更使得白纹伊蚊逐渐由低纬度地区向高纬度地区扩散，从而扩大白纹伊蚊的分布范围(Benedictetal., 2007)。

因此，通过白纹伊蚊的滞育生态学研究，深入分析白纹伊蚊滞育诱导、滞育解除、滞育后发育的机制，探求以白纹伊蚊滞育行为作为方向的新型蚊媒控制方法提供科学依据。