消化时间对鱼肉中囊蚴分离提纯效果的影响研究*

张凤玉 杜凤霞 刘 柳 王晓琳 刘亭亭 张 浩

(齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江齐齐哈尔 161006)

因生食或半生食含有感染期寄生虫的食物而感染的寄生虫病，称为食源性寄生虫病(Chaietal., 2012)。食源性寄生虫病目前在世界范围流行广泛，危害严重(Toledoetal., 2012; Fairweatheretal., 2020)。据Sripa等(2010)的报道，东南亚的食源性吸虫病，包括支睾吸虫病和后睾吸虫病，约有4 000万人感染，7.5亿人受到威胁，超过世界总人口的10%。随着人们生活水平的提高，饮食习惯逐渐多样化，食源性吸虫病已成为威胁人们身体健康的公共卫生隐患(Fürstetal.,2012; Yangetal., 2019)。我国淡水资源丰富，鱼类品种繁多，鱼体内寄生有多种不同类型的吸虫囊蚴(黄安安等, 2015; Yangetal., 2019)。鱼体内囊蚴的分离检测对于这类寄生虫病的预防与控制具有重要意义。通常鱼肉内囊蚴的分离多采用人工消化法，对消化时间有不同报道(蒋峰等, 2018; Woonetal., 2018)，但对不同消化时间分离囊蚴的效果少有详细比较。为获取纯净囊蚴，筛选适宜条件，我们对不同时间消化鱼肉获得的囊蚴进行计数和比较观察，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

从市场分3批次采集淡水鱼，带回实验室检查。实验次数为3次。

1.2 直接压片法

从鱼的背部、尾部、腹部各取绿豆大小的一块肌肉置于两张载玻片之间，用力挤压，使鱼肉呈半透明薄雾状，镜下查找活动囊蚴，任一部位发现即为阳性。

1.3 人工消化法

将阳性鱼去头、尾和内脏，冲洗干净搅碎后将所有阳性鱼混匀分4份，每份取25 g。按1∶10(W/V)的比例放入含有人工消化液的烧杯内，置37 ℃恒温培养箱孵育，消化过程中玻璃棒搅拌3～4次。人工消化液按照胃蛋白酶7 g(1∶3 000)、浓盐酸8 mL、生理盐水1 000 mL进行配置。分别消化4、8、12、16 h后取出烧杯，水洗沉淀后留取沉渣，显微镜镜检囊蚴。参照文献和专著对囊蚴形态进行初步鉴别(Tang,2005; Chenetal., 2017)。

图1 鱼肉消化后的沉渣(40×)Fig.1 Sediment after digestion of fish (40×)消化时间 a：4 h; b：8 h; c: 12 h; d: 16 h。 Digestion time a：4 h; b：8 h; c: 12 h; d: 16 h.

表1 25 g鱼肉消化不同时间含有的囊蚴数Tab.1 The number of metacercaria in 25 g fish meat digested for different time

1.4 囊蚴计数及活力判断

将沉渣离心后保留沉淀物与上清液共5 mL，吸管吸取沉渣及囊蚴。用加样枪吸取50 μL沉淀物于载玻片上，镜下计数沉淀物内的囊蚴。在显微镜下持续观察1 min，囊蚴内幼虫有伸缩活动即为存活虫体。

1.5 统计学分析

用SPSS 26.0进行统计分析。不同实验次数不同时间获取的囊蚴数采用方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 沉渣背景

消化4 h的沉渣液体浑浊、颗粒粗大、块状絮状物较多，囊蚴不易分辨、吸取(图1-a)；消化8、12、16 h的沉渣液体整体较澄清，颗粒偏小且少，囊蚴周围视野清晰，易分离和收集(图1b-d)。

2.2 囊蚴分离效果

人工消化液对鱼肉消化4、8、12、16 h获取的囊蚴数目不等，差异具有统计学意义(F=20.414,P<0.05)。三次实验，在鱼肉消化8 h获得的囊蚴数目最多，分别为33.0、36.0、30.0个，平均含有囊蚴(33.0±3.00)个。鱼肉消化8 h分别与消化4 h平均(14.0±1.53)个、16 h(19.0±4.04)个囊蚴比较，两者之间差异显著(P<0.05)，但与消化12 h比较，二者之间统计学差异不明显。鱼肉消化4 h获得的囊蚴平均数最少，50 μL沉渣平均含有囊蚴(14.0±1.53)个，见表1。

图2 囊蚴活体(400×)Fig.2 Live metacercaria(400×) a: 华支睾吸虫囊蚴；b：东方次睾吸虫囊蚴；c：台湾次睾吸虫囊蚴。a: Clonorchis sinensis；b: Metorchis orientails c: Metorchis taiwanensis.

2.3 囊蚴形态和活性

鱼肉消化4、8、12、16 h所得囊蚴皆有活性。华支睾吸虫Clonorchissinensis囊蚴(图2-a)：呈椭圆形或圆形，囊壁两层，透明，外壁较厚，内壁较薄，口腹吸盘大小相近，排泄囊呈“O”形，囊内充满黑褐色颗粒，幼虫迂曲在囊壁内，间断性蠕动。东方次睾吸虫Metorchisorientalis囊蚴(图2-b)：呈椭圆形或圆形，与华支睾吸虫囊蚴形态极其相似，只是囊壁厚度有区别，近似相同大小的口腹吸盘，幼虫在囊内间断性蠕动，“O”形排泄囊。台湾次睾吸虫Metorchistaiwanensis囊蚴(图2-c)：呈圆形，双层囊壁，囊壁厚且透明，排泄囊呈“O”形，口腹吸盘大小相近，囊内充满黄褐色颗粒。

3 讨论

食源性吸虫病主要分布在亚州东北部、中国以及南美等地区(Liuetal., 2014；Wuetal., 2017)。以鱼为媒介的食源性吸虫病种类较多，在中国东北、沿海地区均有报道(Qiuetal., 2017; 谢贤良等, 2019)。淡水鱼体内吸虫囊蚴的分离采用胃蛋白酶消化法比较普遍，曾有研究者用生理盐水配制的消化液对鱼肉消化3、6、16 h进行过比较观察，认为获得的囊蚴数基本相似(陈锡慰等, 1984)。我们在前期工作基础上，通过延长时间对鱼肉进行消化，观察囊蚴分离的效果，得到消化8 h获取的囊蚴数目最多，且各个时间段都能分离到活性良好的囊蚴。鱼肉消化12 h获得的囊蚴平均数为27个，仅次于8 h获得的囊蚴数，因此消化时间设置在8～12 h不仅能够获得较好的分离效果还能节约时间成本，同时避免出现消化时间过少导致囊蚴提取困难、分离效果差等情况。鱼肉消化4 h获得的囊蚴平均数最少，50 μL沉渣平均含有囊蚴14个，也许跟鱼肉消化时间不充足，部分囊蚴被鱼肉遮掩无法观察有关。本次实验，淡水鱼体内获得3种吸虫囊蚴，与以往文献报道基本吻合，说明本地区存在多种食源性吸虫病的可能(刘继鑫等, 2014; 黄安安等, 2015) 。淡水鱼体内吸虫囊蚴的存在也提示人们在日常生活中应养成良好的饮食习惯，可以从源头上控制食源性吸虫病流行(Tangetal., 2016; 蒋峰等, 2018; 孙青松等, 2019)。本实验根据文献和专著对囊蚴形态进行初步鉴别，在后期实验中将采用分子测序方法进行囊蚴种类鉴定；本实验囊蚴活性测定上仅以镜下观察囊内幼虫活动时间为标准，在后续实验中将进一步采用后蚴孵化法进行验证。