某地区新生儿痰标本金黄色葡萄球菌分离株耐药情况及分子特征

黄金华，傅锦坚，梁婧，蓝茜榆（柳州市妇幼保健院，.药学部，2.预防保健科，.新生儿科，广西 柳州 54500）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是临床常见感染病原菌之一，根据2014 至2017年中国儿童及新生儿患者（≤14 岁）细菌耐药监测报告可见[1]：SA 分离率已占儿童及新生儿组革兰氏阳性菌分离率的首位，并呈逐年上升趋势。SA 最常侵犯4 个月以下的婴幼儿，该年龄段SA的阳性分离较高[2]，新生儿免疫系统发育不完善，抵抗力弱，容易感染，为了解本地区新生儿SA 耐药情况及分子特征，对2014—2017年柳州市妇幼保健新生儿病区痰标本分离出的52 株SA 株耐药情况及mecA基因、SCCmec分型、大环内酯类耐药基因（ermA，ermC）、四环素耐药基因（tetM和tetK）、杀白细胞素（panton-valentine leukocidin，PVL）毒力因子的分子特征进行回顾性研究分析，为防治新生儿呼吸道SA 感染提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集本院2014年1月至2017年12月新生儿病区呼吸道痰液送检样本中分离出的SA 株，剔除重复菌株，同一患者只选取一株分离株进行分析，共52 株。

1.2 分离鉴定

细菌的分离鉴定按文献[3]描述的方法进行。根据收集标本当年发布的美国临床和实验室标准化协会所制订的标准采用 CLSI 纸片法检测所有菌株对青霉素、阿莫西林克拉维酸钾、氨苄西林、头孢氨苄、红霉素、克林霉素、庆大霉素、复方新诺明、环丙沙星、左氧氟沙星、四环素、利福平、万古霉素、利奈唑胺这14 种抗菌药物的敏感性。采用头孢西丁纸片扩散法初步检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant SA，MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-susceptible SA，MSSA）。

1.3 耐药基因及PVL 毒力因子基因检测

采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法检测大环内酯类耐药基因（ermA，ermC）、四环素耐药基因（tetM和tetK）[4]、PVL毒力因子基因[5]。参照文献[6-7]采用多重聚合酶链反应（M-PCR）对SA 携带的mecA基因及mecA基因的具体SCCmec分子分型进行检测。引物序列及产物长度条件参考文献[7]，PCR 扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸90 s，30 个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶（0.5 μg·mL－1）染色后成像，记录结果。

1.4 统计学方法

运用统计学软件SPSS 23.0 进行数据分析，对等级变量和率的差异采用χ2检验或Fisher’s 精确检验，所有的检验结果以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分离的SA 对抗菌药物耐药情况及耐药基因检出情况

52 株SA 对青霉素、氨苄西林耐药率非常高，分别为98.08%、73.08%，对利福平、左氧氟沙星耐药率较低（均为1.92%），对环丙沙星、万古霉素、利奈唑胺无耐药，具体见表1。采用头孢西丁敏感试验筛查，同时采用PCR 方法检测mecA基因。头孢西丁敏感试验筛查阳性菌均检出mecA基因，检出MRSA 11 株，检出率为21.15%，SA对氨苄西林、阿莫西林克拉维酸钾、红霉素、头孢氨苄的耐药性较MSSA 高（P＜0.05）。耐药基因仅检出mecA、SCCmecIVd基因、大环内酯类ermC耐药基因、四环素tetK耐药基因和毒力因子PVL 基团，其他耐药基因未检出。其中mecA基因检出12 株，SCCmecIVd基因检出11 株，大环内酯类ermC耐药基因检出12 株，四环素tetK耐药基因检出10 株，毒力因子PVL 基因检出5 株，具体检测情况见表2，部分菌株分型见图1 ～3。

图1 部分菌株mecA 基因PCR 扩增电泳图Fig 1 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for mecA gene

图2 部分菌株SCCmec 分子分型基因PCR 扩增电泳图Fig 2 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for SCCmec gene

图3 部分菌株ermC、tetK、PVL 毒力因子基因PCR 扩增电泳图Fig 3 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for ermC，tetK and PVL virulence gene

表1 SA 抗菌药物耐药情况Tab 1 Antimicrobial resistance of SA

表2 SA 耐药基因及PVL 毒力因子基因检测情况Tab 2 Drug resistance gene and PVL virulence gene

2.2 携带ermC、tetK 耐药基因抗菌药物耐药情况及分子学特征情况

携带ermC耐药基因的金黄色葡萄球菌对红霉素耐药率为75.00%，克林霉素耐药率为66.67%，其中携带mecA基因4 株，SCCmecIVd基因3 株，tetK耐药基因2 株，毒力因子PVL 3 株；携带tetK耐药基因的金黄色葡萄球菌对四环素耐药率为90.0%，其中检出携带mecA基因4 株，SCCmecIVd基因3 株，tetK耐药基因2 株，毒力因子PVL 2 株（见表3 ～6）。

表3 携带ermC 耐药基因对抗菌药物耐药情况Tab 3 Drug resistance of bacteria antibiotics carrying ermC resistance gene

表4 携带ermC 耐药基因及PVL 毒力因子基因检测情况Tab 4 ermC resistance gene and PVL virulence gene

表5 携带tetK 耐药基因抗菌药物耐药情况Tab 5 Drug resistance of bacteria antibiotics carrying tetK resistance gene

表6 携带tetK 耐药基因及PVL 毒力因子基因检测情况Tab 6 tetK resistance gene and PVL virulence gene

3 讨论

3.1 SA 耐药基因检测对抗菌药物选择的影响

SA 的耐药机制比较复杂，可能携带mecA基因、大环内酯类耐药基因（ermC）、四环素耐药基因（tetM和tetK）、PVL 毒力因子等耐药基因及因子，本研究检测出携带大环内酯类ermC耐药基因的菌株相对于未携带大环内酯类ermC耐药基因的菌株对红霉素、克林霉素的敏感性有统计学意义（P＜0.05）；携带四环素tetK耐药基因的菌株相对于未携带四环素tetK耐药基因的菌株对四环素的敏感性有统计学意义（P＜0.05）。当SA 检出携带大环内酯类ermC耐药基因时，则不宜选择大环内酯类抗菌药物、林可酰胺类抗菌药物抗感染治疗；如检出携带四环素tetK耐药基因时，则不宜选择四环素类药物抗感染治疗。

mecA基因编码的青霉素结合蛋白2a（PBP2a）能够替代结合失活的PBPs 发挥转肽酶的功能，促进细胞壁的合成而产生耐药性[8]。由于MRSA 产生的耐药是因MRSA 获得mecA基因，编码产生新的青霉素结合蛋白2a（PBP2a），造成对β-内酰胺类药物耐药，CLSI 明确指出一旦在SA 中检测到mecA基因，即可认定为MRSA[9]。本研究中有1 株SA 菌株头孢西丁筛查试验阴性，但检出mecA基因阳性，则仍可认定这株菌株为MRSA。

SCCmec 盒式染色体是一种新型的可移动元件，大小为 21 ～67 kbp，该元件主要包括mec基因复合体和染色体重组酶基因ccr复合体。根据mec和ccr基因复合体结构不同，可将SCCmec主要分为5 种基因型[10-11]。医院感染MRSA 菌株多携带SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，社区感染 MRSA 菌株多携带SCCmecⅣ、Ⅴ。本研究检出的12 株携带mecA基因的SA，同时携带SCCmecIVd基因，考虑来自于社区获得性感染。因社区健康儿童鼻前庭SA 定植率可达38.9%[12]，在临床治疗上首先要判断是定植菌还是致病菌，以减少不必要的抗菌药物使用，促进临床抗SA治疗的合理性。

PVL 是由SA 产生的一种外毒素，可引起机体释放多种炎性介质，引发血管扩张、炎性细胞浸润、组织坏死等一系列炎性反应，最终使细胞坏死或凋亡而危及生命。本研究的SA 株主要来自呼吸道标本，共检出5 株菌株携带PVL毒力因子，其中携带ermC耐药基因的SA 中检出PVL 毒力因子3 株，未携带ermC耐药基因的SA 中检出PVL 毒力因子2 株，如采用χ2检验时P＜0.05，差异有统计学意义。但因当1 ≤理论数（T）＜5，n≥40 时，采用Fisher’s 精确检验计算P＞0.05，则差异无统计学意义。不同地区SA 所携带的耐药基因及毒力等情况可能会有所不同，如一项对1992—2010年医院MRSA克隆分布的研究显示：分离出携带ermC介导的红霉素和克林霉素耐药的MSRA 菌株检出PVL呈阴性[13]，而一项携带PLV 毒力因子的MRSA研究中发现：MRSA 分离菌中检出携带PVL 毒力检出率为29.2%，其中携带ermC耐药基因占18.6%，是最常见的耐药基因[14]。

3.2 结语

因新生儿的特殊生理特点，复方新诺明、四环素、左氧氟沙星、环丙沙星不能用于新生儿，庆大霉素等氨基糖苷类抗菌药物因耳毒性、肾毒性等不良反应，儿童须在监测药物血药浓度的前提下谨慎使用，一般也不首选，因此对于新生儿SA 的药物治疗选择上比较局限。本研究发现，本地区新生儿痰液中检出的SA 对青霉素、氨苄西林耐药高，因此在临床上新生儿抗SA 治疗不应选用青霉素、氨苄西林作为SA 的常规抗感染治疗用药，对于MSSA 可选择红霉素、阿莫西林克拉维酸钾、头孢氨苄作为首选治疗方案，对于MRSA 则选用万古霉素、利奈唑胺治疗。对于检出大环内酯类耐药基因的SA 菌株，除了对大环内酯类药物耐药外，对克林霉素耐药比例也比较高，因此，应同时做克林霉素诱导试验（即D 试验），以便为临床用药提供参考。