苦参碱及其氯化钠注射液有关物质检查方法研究

严菲，顾小燕，陈民辉，曹玲*（. 江苏省食品药品监督检验研究院，南京 009；.中国药科大学，南京 98）

苦参是豆科植物苦参的干燥根，味苦，性寒，其主要功效为清热燥湿，杀虫，利尿，用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮等病症[1]。苦参碱是苦参中含量最高的主要活性成分之一，其分子结构式见图1，属于四环噻嗪啶类。苦参碱具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等作用[2]，孙静等[3]研究结果显示苦参碱对人冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺证小鼠病证结合模型具有显著的治疗作用。

图1 苦参碱结构式Fig 1 Structural formula of matrine

苦参碱及其氯化钠注射液在各国药典中均未收载，现行国家标准[4-5]中有关物质检查采用HPLC 法，但仅控制总杂质含量。苦参碱原料在强碱破坏等条件下能产生槐定碱、氧化苦参碱和槐果碱等杂质，文献报道[6-7]苦参碱和槐果碱在一定条件下能转化成较为稳定的氧化形态，即氧化苦参碱和氧化槐果碱。因此，本文拟确定氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和槐定碱为苦参碱原料及氯化钠注射液中可能存在的已知杂质。在现行标准色谱条件下，上述5 种目标物质无法完全分离，且同时分析苦参碱原料及其氯化钠注射液中苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和槐定碱的色谱方法尚未见报道。

本文在参考文献方法[8-9]的基础上，优化了现行标准中有关物质的色谱条件，使5 种目标物质均能良好分离，为科学修订苦参碱及其氯化钠注射液的有关物质方法提供参考和依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CPA225D 型电子天平（德国赛多利斯天平公司）；LC-20AB 高效液相色谱仪（岛津公司）；Milli-Q 超纯水仪（Millipore 公司）；Branson 8800超声波清洗仪（Branson 公司）；DHG-9041A 电热恒温干燥箱（精宏实验设备公司）；Seven mile pH 计（梅特勒公司）。

1.2 试药

磷酸二氢钾、三乙胺（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，Tiedia 公司）；水为超纯水。对照品苦参碱（批号：110805-202010，纯度：98.7%）、氧化苦参碱（批号：110780-201909，纯度：92.5%）、氧化槐果碱（批号：111652-200301，纯度：100.0%）、槐定碱（批号：110784-201706，纯度：98.8%）（中国食品药品检定研究院），槐果碱（批号：X3420010，纯度：98.17%，上海安谱实验科技股份有限公司）。样品基本信息见表1。

表1 样品信息Tab 1 Information of sample

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol·L－1磷酸二氢钾溶液[用三乙胺调节pH 值至（6.2±0.1）]（10∶90）；流速：1.0 mL·min－1；进样量：10 μL；检测波长：220 nm；柱温：30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 系统适用性溶液 取苦参碱原料及各杂质对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成含苦参碱0.8 mg·mL－1和各杂质10 μg·mL－1的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取苦参碱原料适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成0.8 mg·mL－1的溶液，作为苦参碱原料供试品溶液；取苦参碱氯化钠注射液作为苦参碱氯化钠注射液供试品溶液。

2.2.3 对照溶液 精密量取供试品溶液1 mL，加流动相定量稀释制成8 μg·mL－1的溶液，作为对照溶液。

2.2.4 对照品储备液 精密称取苦参碱对照品和已知各杂质对照品各10 mg 于10 mL 量瓶中，用流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度约为1 mg·mL－1的混合对照品储备液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 精密量取“2.2.1”项下系统适用性溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图2。结果表明，各杂质与苦参碱之间、各杂质之间分离度均大于1.5。

图2 苦参碱系统适用性色谱图Fig 2 Chromatogram of matrine for system suitability

2.3.2 专属性试验 ① 酸破坏溶液：称取苦参碱原料约16 mg，置20 mL 量瓶中，加6 mol·L－1盐酸溶液2 mL，放置24 h，用6 mol·L－1氢氧化钠溶液调节pH 值至中性，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过；② 碱破坏溶液：称取苦参碱原料约16 mg，置20 mL 量瓶中，加6 mol·L－1氢氧化钠溶液2 mL，放置24 h，用6 mol·L－1盐酸溶液调节pH 值至中性，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过；③ 氧化破坏溶液：称取苦参碱原料约16 mg，置20 mL 量瓶中，加30%过氧化氢溶液2 mL，放置24 h，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过；④ 高温破坏溶液：称取经60 ℃加热6 h 后放冷的苦参碱原料约16 mg，置20 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；⑤ 光照破坏溶液：称取置（4500±500）Lx光照了24 h 的苦参碱原料约16 mg，置20 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。分别精密吸取上述5 种溶液各10 μL 注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图3。由图可知，破坏试验产生的杂质之间、杂质与主成分之间分离效果良好，表明该方法专属性强。

图3 苦参碱专属性试验色谱图Fig 3 Chromatogram of the specific properties of matrine

对征集到的空白辅料，用流动相配制成空白辅料溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，考察混合辅料对有关物质检查的影响。色谱图见图4。结果表明辅料对苦参碱有关物质检查无干扰。

图4 苦参碱氯化钠注射液空白辅料溶液色谱图Fig 4 Chromatogram of matrine sodium chloride injection for blank auxiliary solution

2.3.3 苦参碱与杂质的标准曲线及各杂质相对校正因子的测定 精密吸取对照品储备液适量，加流动相稀释制成分别含苦参碱和各杂质质量浓度约为1、5、10、25、50、100、250 μg·mL－1的系列对照品溶液。精密吸取上述5 种溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定保留时间和峰面积。以溶液质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归；以苦参碱为参照物，用标准曲线法计算得各杂质的相对校正因子，结果见表2。根据《中国药典》（2020年版）四部9102 药物杂质分析指导原则及化学药物杂质研究的技术指导原则，杂质的校正因子在0.9 ～1.1，可采用主成分的自身对照法进行定量测定，其余杂质采用加校正因子的主成分自身对照法进行定量测定。

2.3.4 定量限和检测限的测定 取上述线性对照品溶液逐步稀释，精密吸取10 μL 注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，以S/N≈10 为定量限，S/N≈3 为检测限，结果见表2。

表2 苦参碱和各杂质相对保留时间、线性关系和相对校正因子的测定结果Tab 2 Determination results of relative retention time，linearity and relative correction factor of matrine and impurities

2.3.5 精密度试验 精密吸取质量浓度为10 μg·mL－1的混合对照品溶液10 μL 注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，平行进样6次，记录峰面积，结果显示苦参碱及各杂质峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性考察

① 苦参碱原料：取苦参碱原料（批号：20170211），按“2.2.2”和“2.2.3” 项下方法平行制备供试品溶液和对照溶液各6 份，进样测定，结果苦参碱原料中各杂质、单个最大未知杂质及总杂质含量RSD＜5%，表明方法重复性良好。

② 苦参碱氯化钠注射液：取苦参碱氯化钠注射液（批号：20010542），按“2.2.2”和“2.2.3” 项下方法平行制备供试品溶液和对照溶液各6 份，进样测定，结果苦参碱氯化钠注射液中各杂质、单个最大杂质及总杂质含量RSD＜5%。

2.3.7 回收试验

① 苦参碱原料：分别精密量取对照品储备液和已知杂质含量的同一批苦参碱原料适量，加流动相制成含各杂质和苦参碱分别约为10 μg·mL－1、0.8 mg·mL－1的溶液，按“2.2.3”项下方法制备对照溶液，平行制备6 份，按“2.1”项下色谱条件进样分析。表3 结果表明可以采用该方法对苦参碱原料中已知各杂质进行定量分析且准确度好。

表3 苦参碱原料的回收试验结果(%)Tab 3 Recovery of matrine (%)

② 苦参碱氯化钠注射液：分别精密量取对照品储备液适量，用已知杂质含量的同一批苦参碱氯化钠注射液剂制成含各杂质和苦参碱分别约为10 μg·mL－1、0.8 mg·mL－1的溶液，按“2.2.3”项下方法制备对照溶液，平行制备6 份，按“2.1”项下色谱条件进样分析。表4 结果表明可以采用该方法对苦参碱氯化钠注射液中已知各杂质进行定量分析且准确度好。

表4 苦参碱氯化钠注射液的回收试验结果Tab 4 Recovery of matrine sodium chloride injection

2.3.8 稳定性试验 按“2.2.2”项下方法配制苦参碱原料及其氯化钠注射液供试品溶液，在室温下放置，分别于0、2、4、8、12 h 进样分析，结果显示12 h 内苦参碱原料及其氯化钠注射液供试品溶液中各杂质和杂质总量RSD均小于0.5%，表明两者溶液稳定性良好。

2.4 苦参碱原料及其氯化钠注射液有关物质测定

精密称取苦参碱及氯化钠注射液，按“2.2.2”和“2.2.3”项下方法配制，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表5。

表5 苦参碱及苦参碱氯化钠注射液的杂质含量测定结果Tab 5 Content of impurity of matrine and matrine sodium chloride injection

3 讨论

3.1 色谱系统的选择

苦参碱原料药现行标准中有关物质检查项采用的流动相为乙腈-水（用磷酸调节pH 值为2.0）-乙醇＝80∶10∶8，色谱柱为NH2柱；其氯化钠注射液现行标准中有关物质流动相采用乙腈-磷酸溶液（100 mL 水加三乙胺0.2 mL，用磷酸调节pH值至3.2）＝4∶96，色谱柱为C18柱。试验发现上述两种色谱系统均不能很好地分离5 种目标物质，且NH2柱色谱系统基线波动很大，重现性更差。因此，本试验选择C18柱色谱系统进行优化。

3.2 流动相的选择

考察了4%、10%、15%乙腈的比例对各色谱峰出峰时间的影响，结果表明乙腈比例越高出峰时间越快，10%乙腈条件下各色谱峰保留时间合适，各峰分离度良好；考察了0.01、0.02、0.05 mol·L－1磷酸二氢钾溶液浓度对各色谱峰峰形及分离度的影响，结果表明磷酸二氢钾溶液浓度越高峰形越好，分离度影响不大，故选择0.05 mol·L－1浓度的磷酸二氢钾溶液；进一步考察水相的pH，用三乙胺调节pH 值至5.0、5.6、6.2、6.8，随着水相pH 值的增加，各峰分离度明显改善，且pH 为6.2 时，苦参碱保留时间约为11 min，故最终选择流动相为乙腈-0.05 mol·L－1磷酸二氢钾溶液[用三乙胺调节pH 值至（6.2±0.1）]（10∶90）。

3.3 色谱柱的选择

采用3 种不同品牌色谱柱[Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU VPODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]考察其对5 种目标物质之间分离度的影响，最终选择Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，可以达到良好分离测定的要求。