盐酸倍他司汀中基因毒性杂质甲醛的测定

李沫，张耀文，孙苓苓，徐万魁（辽宁省药品检验检测院，国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室，沈阳 110036）

盐酸倍他司汀（betahistine hydrochloride）化学名为N-甲基-2-吡啶乙胺二盐酸盐，商品名为美克乐（Microer），是由意大利佛曼蒂（Formenti）制药集团开发的一种组胺H1受体激动剂，是一种常用的血管扩张药，临床上主要用于治疗各种眩晕综合征、慢性缺血性脑血管疾病、美尼尔氏综合征和相关的眩晕症状[1-4]。

甲醛是一种有特殊刺激性气味的无色气体，易溶于水和乙醇，作为重要的化工原料被广泛应用于有机合成、合成药品、材料、涂料、橡胶等行业[5-7]。甲醛是盐酸倍他司汀在合成过程中的残留溶剂之一。基因毒性杂质可从基因突变、染色体畸变、DNA 损伤与修复等多个方面同DNA 发生直接或间接的相互作用，从而改变DNA 的结构与构象或引起DNA 的损伤，进而影响DNA 的功能或改变其遗传特性，最终引起突变、癌变、畸变等遗传毒性[8-11]。甲醛是确定的基因毒性杂质，人体长期接触甲醛会对呼吸系统、皮肤、肝肺功能和神经系统等造成危害。

近年来，随着基因毒性杂质法规的逐渐完善，美国和欧洲药品监督管理对药品中含有潜在基因毒性杂质的限度要求越来越高，药物中基因毒性杂质如果控制不当，可能会导致临床安全隐患，同时会影响新药上市，甚至导致已上市药品的召回事件[9]。开展盐酸倍他司汀中基因毒性杂质质量控制的研究是非常必要的，故本研究建立了盐酸倍他司汀原料中基因毒性杂质甲醛的分析方法，以保证盐酸倍他司汀原料的安全性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

GC-2010Plus 型气相色谱仪（配有AOC-5000型自动进样器和氢火焰离子化检测器，日本岛津公司），ALC-1100.2 型分析天平（瑞士Sartorius 公司），ME204E 型分析天平（美国Mettler 公司）。

1.2 试药

水中甲醛溶液标准物质（中国计量科学研究院，批号：18001，含量：9.69 mg·mL－1），盐酸倍他司汀（A 厂原料药，批号：202010、202012、202016），纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司，批号：20200301）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用气相色谱法测定，色谱柱：DB-624（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；检测器：氢火焰离子化检测器（FID）；进样口温度：230℃；检测器温度：250℃，程序升温：起始温度为40 ℃，以20 ℃·min－1的速率升温至200 ℃，维持1 min；载气：氮气；柱流速：3.0 mL·min－1；进样方式：溶液直接进样，进样量：1 μL，分流比：1∶1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密量取水中甲醛溶液标准物质，用水逐级稀释至质量浓度为5.5 ng·mL－1，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液1 mL置20 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（质量浓度为0.275 ng·mL－1）。

2.2.2 供试品溶液 精密称取盐酸倍他司汀0.1 g 置10 mL 量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别量取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂（水）进样，记录色谱图，结果见图1，空白溶剂色谱峰不干扰测定。

图1 空白溶剂（A）、对照溶液（B）和供试品溶液（C）气相色谱图Fig 1 GC chromatogram of the blank solution（A），the control solution（B）and the reference solution（C）

2.4 线性关系考察

取对照品储备液适量并稀释成系列质量浓度溶液，进样，记录色谱图，以各成分色谱峰面积（A）为纵坐标，以质量浓度（C）为横坐标，进行线性回归。结果表明，甲醛在0.055 ～1.109 ng·mL－1与测定值线性关系良好，线性方程为A＝1.76×104C＋2.20×103，r＝1.000。

2.5 定量限与检测限

精密量取“2.4”项下0.055 ng·mL－1的溶液适量，稀释后进样，以色谱峰的信噪比S/N为3 计算检测限，以S/N为10 计算定量限。结果表明，甲醛的检测限为0.018 ng·mL－1，定量限为0.055 ng·mL－1。

2.6 精密度试验

2.6.1 重复性试验 称取盐酸倍他司汀0.1 g，精密称定，置10 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，加甲醛对照品储备液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行操作6 份，分别进样，结果6 份供试品溶液中甲醛含量均值为0.269 ng·mL－1，RSD为0.70%，表明该方法重复性良好。

2.6.2 中间精密度试验 照“2.6.1”项下方法配制溶液，在不同时间由另一名试验人员进样测定，记录峰面积，计算含量。结果12 份供试品溶液中甲醛含量均值为0.269 ng·mL－1，RSD为0.60%，表明该方法中间精密度良好。

2.7 回收试验

称取盐酸倍他司汀0.1 g（甲醛含量为0），精密称定，置10 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，分别精加甲醛对照品储备液0.8、1.0 和1.2 mL，每个浓度3 份，用水稀释至刻度，摇匀，作为回收率样品溶液。取回收率样品溶液和“2.2”项下对照品溶液，分别进样，计算得甲醛低、中、高浓度的平均回收率分别为100.6%、96.9%、97.0%，RSD分别为0.79%、2.1%、1.9%。

2.8 耐用性试验

按“2.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别考察起始柱温[（40±5）℃]、柱流速[（3±5）mL·min－1]条件对试验结果的影响，并考察相同填料、不同色谱柱[TG-624（30 m×0.32 mm，1.8 μm），TG-624（30 m×0.53 mm，3 μm）]对试验结果的影响。结果显示试验条件的变动对保留时间、分离度、样品检出情况影响较小，方法耐用性良好。

2.9 稳定性试验

按“2.6.1”项下方法配制溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h 进样，考察峰面积的RSD，结果表明对照品溶液和供试品溶液RSD分别为0.48%和0.64%，溶液在10 h 内稳定。

2.10 样品测定

按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果样品中均未检出甲醛。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

待测物甲醛和样品盐酸倍他司汀在水中均有良好的溶解性，尤其是甲醛，考虑到其标准物质是水溶液，故选择水作为溶剂。

3.2 检测方法的选择

目前检测药品中微量的甲醛，主要的测定方法有分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和高效液相/气相色谱-质谱联用法（HPLC/GC-MS）等[12]。前3种方法，样品都需要衍生化后再进行测定，试验操作繁琐，检验灵敏度低。HPLC/GC-MS 法具有灵敏度高、分辨率高、检测限低等优点，但是仪器成本较为昂贵，应用不够广泛。本研究选择气相色谱直接进样法，操作简单快捷，避免了样品预处理的繁琐步骤和试剂消耗量大的缺点，同时满足了检测灵敏度的需求，为甲醛的检测提供了切实可行的试验方法。

3.3 色谱条件的选择

本试验选用DB-624 毛细管色谱柱（固定液为6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷），此色谱柱对弱极性有机溶剂有较好的适用性。为了使样品不干扰测定，本试验采用程序升温的方法，并对升温条件进行了优化，使待测物有比较合适的保留时间的同时，样品中的成分不干扰待测物的分离。

3.4 甲醛限度确定的依据

根据毒理数据查询CPBD（致癌效力数据库）可知，甲醛的最小毒理学数据TD50＝1.35 mg/（kg·d），ADI ＝TD50/5000×50 kg ＝1.35 μg·d－1，盐酸倍他司汀最大日剂量Dose 为50 mg·d－1，最终甲醛的限度为ADI/Dose ＝2.7×10－5g·g－1。