两广地区地龙中22种无机元素量变规律研究

陈林明，林晓坤，王智民，杨群华，黄寿辉（广州汇标检测技术中心，广州 510700）

地龙又名蚯蚓，始载于《神农本草经》，为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vu1garisChen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen 的干燥体。前一种习称“广地龙”，后3 种习称“沪地龙”。广地龙春季至秋季捕捉，沪地龙夏季捕捉，及时剖开腹部，除去内脏和泥沙，洗净，晒干或低温干燥作即得地龙药材[1]。

地龙药用能清热定惊、通络、平喘、利尿，在临床主要用于高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肢体麻木、半身不遂、肺热喘咳、水肿尿少等的治疗[1]。现代研究表明，地龙具有抗凝血、促进创面愈合等作用，这与其含有的无机微量元素有关[2]。例如，硫化汞（HgS）就具有中枢神经抑制的药理作用[3]。但随着工业对土壤与水环境的重金属污染加剧，地龙机体中富集的重金属含量也增加，导致中药地龙重金属超标，使人体健康受到潜在威胁[4-5]。

目前，中药无机元素含量研究集中在重金属元素，然而，非重金属元素的研究仍然偏少，各类药材的无机元素研究仍不全面[6]。例如，二氧化硫的检测研究较多，但对于硫元素检测的报道则较少。此外，对于同一种药材，因产地不同而其钾含量存在着巨大差异，如菊花含钾量在790 ～53 200 mg·kg－1[6]。因此，非重金属元素的测定同样具有现实意义。本研究采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对广西、广东地区地龙中22 种无机元素（5 种常量元素与17 种微量元素）进行测定，并对元素之间相关性及量变规律进行了分析，为中药地龙的质量评价提供参考。

1 仪器与试药

7900 型电感耦合等离子体质谱（美国安捷伦公司）；ETHOS UP 型微波消解仪（意大利Milestone 公司）；XPE26 微量天平、XS205DU电子天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）；DHG-9013A 电热鼓风干燥箱（上海一恒仪器有限公司）；KS-500E1 超声波清洗机（福州瑞豪医疗器械有限公司）；Milli-Q 型超纯水机（Millipore Bedford MA，美国）；TH-Ⅱ型数控薄层显色加热器（上海科哲生化科技有限公司）。

Multi Element Standards 2A 27 种标准溶液包含Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn（部件号8500-6940，美国Agilent公司，质量浓度10 mg·L－1）；SPEXertificate 9 种标准溶液包含Mo、Pd、Re、S、Sb、Si、Sn、Ti、W（批号：1-194AB）、SPEXertificate 20 种标准溶液包 含B、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、W（批号：2-192AB）（美国SPEX 公司，质量浓度1000 μg·mL－1）；内标溶液：73Ge（批号：GSB04-1728-2004）、115In（批号：GSB04-1731-2004）、209Bi（批号：GSB04-1719-2004）的单元素标准溶液（1000 μg·mL－1，中国计量科学研究院国家标准物质研究中心）；色谱级硝酸（Fisher scientific 公司）；高纯氩气（福州联创特种气体有限公司）。

30 份样品（编号为S1 ～S30）均于2020年5月购自药材市场，其中S1 ～S14 产于广东省，S15 ～S30 产于广西壮族自治区。所有样品由福建中医药大学药学院杨成梓副教授鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）的干燥体（习称“广地龙”）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品与空白溶液的制备 精密称取样品粉末0.5 g（过5 号筛）于微波消解罐中，加硝酸8.0 mL，放置过夜，按操作规程进行消解处理：先经10 min 由室温升温至130 ℃，并维持5 min 消解，再10 min 由130℃升温至165℃，并维持10 min 消解，然后15 min 由165℃升温至180 ℃，并维持30 min 消解。消解完毕后，放冷，取出消解罐置于加热板上将酸挥尽，冷却后将消解液转移至50 mL 量瓶，并洗涤消解罐3 次，洗液合并至量瓶中，用超纯水定容后摇匀，即得供试品溶液。同法同步制备试剂空白溶液试验。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密量取Si、S、Ti、W、Pb 的混合对照品母液，标记为混标1；精密量取元素Li、Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba 的混合对照品母液，标记为混标2，用5%HNO3把混标1 和混标2 稀释成5、10、20、50、100 μg·mL－1的混合对照品。

2.2 测定条件

质谱条件：仪器自动调谐设定工作参数，以灵敏度、背景、稳定性等各项指标对仪器的工作参数进行优化。测定条件：等离子射频功率1550 W，等离子气体15 L·min－1，辅助气体流量1 L·min－1，雾化气流量1 L·min－1，补偿/稀释气体1 L·min－1，雾化室温度2℃，蠕动泵速度0.3 r·min－1。积分时间1 s，延迟时间1 s，重复次数3 次；测量方式：标准曲线法；读数方式：峰强。以73Ge、115In、209Bi 为内标。

2.3 标准曲线的制备

根据试样中待测元素的水平配制标准溶液，依次测定20 种无机元素的系列质量浓度标准溶液，加入73Ge、115In、209Bi 内标溶液，同法配制标准空白溶液。Li、Na、Mg、Al、Si、S、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr 以73Ge 为内标，Cd、Ba 以115In 为内标，W、Pb 以209Bi 为内标。以对照品质量浓度为横坐标（X），以待测元素与相应内标计数值的比值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。计算各元素标准品的回归方程、相关系数和线性范围。结果各元素在0 ～100 μg·L－1与测定值线性关系良好，在测各元素时，记录测量11 次空白溶液所产生的信号值，计算标准偏差，以3 倍标准偏差时的浓度作为检测限，详见表1。

表1 22 种无机元素的线性回归方程，相关系数，检测限和线性范围Tab 1 Linear regression equation，relevant coefficient，detection limit and linearity for 22 elements

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取混合对照品溶液连续进样6 次，22 种无机元素的RSD值在1.2%～3.0%，表明仪器的精密性良好。

2.4.2 重复性试验 精密称取样品（S13）6 份，制成供试品溶液，测定22 种元素的含量。除Li、Cr、Ni 未检出，Na、Mg、Al、Si、S、K、Ca、Ti、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、W、Pb 的含量均值分别为0.76、0.69、0.57、0.06、7.96、9.87、0.13、0.01、0.02、0.87、0.01、0.23、0.02、0.01、0.01、0.01、0.02、0.02、16.22 mg·kg－1，对应RSD值均在1.6%～3.0%，说明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取样品（S13）1 份，制成供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24 h测定22 种元素的含量。除Li、Cr、Ni 未检出，其余元素的RSD值均在1.3%～2.5%。表明待测溶液在24 h 内稳定。

2.4.4 加样回收试验 精密称取已测定的地龙样品（S13）6 份，每份0.5 g，精密加入一定量的各元素的标准溶液，测定其含量，计算22 种元素的回收率。除Li、Cr、Ni 未检出，其余元素回收率分别在98.7%～103.3%，RSD值均在1.5%～2.7%。

2.5 样品含量测定

按“2.1”项下方法制备各地龙样品的供试品溶液，按“2.2”项下条件测定各样品中22 种无机元素的含量。30 份地龙样品中22 种无机元素的含量见表2。

3 结果与分析

3.1 直观分析

由表2 可知，部分元素含量差别较大。在30 份样品中，3 种元素Li、Cr、Ni 均未检出，5种元素Ti、Cu、As、Sr、Cd 未检出样品占全部样品的比率分别约为40%、13%、17%、23%、47%。另外，仅有2 份样品含有W。根据现行《中国药典》对地龙规定的部分重金属元素限量标准：重金属总量（以Pb 计）不得过30 mg·kg－1，由表2 可见，有33.3%的样品Pb 超标，同时Pb 是所有样品中被测元素含量最高的元素，说明广地龙生长环境存在Pb 污染情况，这可能与两广地区电镀、印染等工业发展有关。

表2 广地龙22 种元素的含量(mg·kg－1)Tab 2 Content of 22 elements in pheretima (mg·kg－1)

3.2 Mann-Whitney U 检验分析

由于数据属于非正态分布，在SPSS 23.0 统计软件中，采用Mann-Whitney U 检验分析广东、广西地龙中各元素含量的差异。结果显示，广东、广西地龙中Pb、Sr、Zn 含量有明显差异（P＜0.05），两地的地龙所含其他19 种元素含量无显著性差异。

3.3 广地龙无机元素特征图谱分析

根据定量测定的元素结果，将30 份样品的22 种元素按原子序数顺序制作含量分布曲线，形成广地龙元素指纹图谱。由图1 可知30 份样品呈现相似的峰形，且各元素含量分布呈现规律性的波动。显然，地龙所含S、K、Pb 元素含量较高，其中含S 较多可能是由于地龙含有许多带二硫键的核酸酶样蛋白，例如EWD1、EWD2 等，这些多肽类成分具有良好的抗纤维化作用[7]；但地龙中含Pb 量最高，值得相关养殖企业关注。

图1 广地龙22 种元素指纹图谱Fig 1 Fingerprint of 22 elements in pheretima

3.3 主成分分析

把30 份样品的结果代入SIMCA 14.1 软件中，点击“summary of fit”，得到2 个主成分，其中R2X 为0.43，Q2为0.125，表明当前2 个主成分的模型预测能力较差，故不进一步分析各主要成分解析表达式与各样品的主成分综合得分。点击“scores”得到主成分得分图（见图2），可以看出样品S14 是PCA 分析中的异常点，此外，来自广东的地龙S1 ～S13（Group 1）基本与主成分t[2]成正相关，而来自广西的地龙S15 ～S30（Group 2）则成负相关，即PCA 能够区分两个地区的地龙。点击"loadings"，系统自动剔除Li、Cr、Ni（均未检出）与W（所有样品中仅2 份样品有检出，数据缺乏整体代表性），得到加载散点图（见图3），18 种元素分布于区间p[1]－0.2 ～0.5，p[2]－0.3 ～0.4，说明18 种无机元素的分布基本呈均匀分散。

图2 30 批样品在元素含量主成分的分布图Fig 2 Distribution of 30 batch samples in principal components of elements’ contents

图3 22 种元素加载散点图Fig 3 Loading scatter plot for 22 elements

3.4 聚类分析

数据导入SPSS 软件，平方欧氏距离法，得到系统聚类分析结果，如图4 所示。所有样品被分成两大类，样品S1 ～S12 及S15 聚成一大类（Group 1），剩余样品聚成另一大类（Group 2）。在Group 1 中，样品S1 ～S12 均来自广东，仅S15 来自广西类似地，在Group 2 中绝大部分样品来自广西。说明系统聚类分析无法100%区分广东和广西地龙；但从22 种无机元素含量角度可发现广东、广西地龙之间整体存在明显的差异。具体临床疗效是否存在差别还有待后期深入研究。

图4 所有样品聚类分析图Fig 4 Cluster analysis for all samples

3.5 相关性分析

除去Li、Cr、Ni（未检出），对所有样品的剩余19 种元素含量进行Person 相关性分析，结果表明，Al、Cu、Fe、Ti 互成正相关（P＜0.01），此外成正相关的还有：As 与Zn；Ba 与Ca、Sr；Ca 与Sr；Cu 与Sr（P＜0.01）；Al 与Mg；Ba 与Cu、Pb、W；Ca 与Mn；Cd 与K、Se；Cu 与Na；Fe 与Mg；K 与Na；Mg 与Na；Pb 与Sr、Zn；Sr 与W、Zn（P＜0.05）。成负相关的有：Al 与Zn；K 与Mn；Mg 与Pb（P＜0.05）；Mg 与Ti（P＜0.01）。

4 讨论

本研究所测22 种元素中，5 种为常量元素（Na、Mg、S、K、Ca），其余17 种为微量元素。其中，人体必需微量元素有6 种：Fe、Cu、Zn、Se、Cr、Sr，非必需微量元素有4 种：Ba、Ti、Li、W，可能必需微量元素有3 种：Mn、Si、Ni，有害元素有4 种：As、Cd、Pb、Al。参照《中国居民膳食营养素参考摄入量第2 部分：常量元素》（WST 578.2—2018）标准，所测30 批地龙样品中，5 种常量元素含量均符合规定。参照《中国居民膳食营养素参考摄入量第3 部分：微量元素》（WS/T 578.3—2017）标准，所测30 批地龙样品中，6 种人体必需微量元素含量均符合规定。4 种非必需微量元素的人体正常摄入值暂无标准可依。30 批样品中有害元素As、Cd 的含量均远低于《中国药典》2020年版（四部9302 中药有害残留物限量制订指导原则）规定限量值[8]，但Pb含量均超标1 ～8 倍，提示地龙养殖环境存在Pb污染。1989年，世界卫生组织把Al 列为食品污染源之一，建议每日Al 摄入量应控制在4 mg 以下，过多摄入会损害脑细胞，30 批样品中Al 元素含量均低于3 mg·kg－1，相对安全。

30 批样品中，除Pb、Al 外，S、Ka、Fe、Zn含量较高。其中，生物体内S 元素是某些蛋白的关键元素，有助于人体软组织损伤的再生修复[9]。地龙富含有一种特殊物质：金属硫蛋白，该蛋白含量高会使S 含量变高[7]。目前普遍认为K 对人体有益，但过量摄入会导致心肾功能障碍[10]。研究表明，胎菊、北板蓝根、蝉蜕等药材含K 超过3000 mg·kg－1，可能与土壤使用钾肥有关。本研究所测地龙含K 量均低于15 mg·kg－1（远低于3000 mg·kg－1），因此相对安全。Fe 元素是血红蛋白的重要组成成分，主要用于氧气的运输，地龙Fe 含量高利于其发挥通络之功效。研究表明，Zn 元素利于伤口愈合，其加速创面愈合功效可能与地龙含较多Zn 有关[10-11]。

本研究发现，主成分分析能够区分广东、广西地区的地龙，这与聚类分析结果一致，说明两广地区的地龙在整体上存在无机元素含量的差异。根据Mann-Whitney U 检验分析结果可知，该差异主要是由于两个地区地龙中Pb、Sr、Zn含量均存在显著差异所致。且相关性分析结果显示Pb、Sr、Zn 元素的含量互成显著正相关。文献报道，广地龙对Zn、Pb 具有较强的生物富集作用[11]。类似地，曾林等[12]用不同Pb 质量分数浓度的土壤驯养地龙，发现地龙对Pb 的富集量随时间的增加。综上可以推测，两广地区生态环境中Pb、Sr、Zn 元素的含量存在显著差异；同时，地龙对这3 种元素具有较强地生物富集作用。

广地龙的主产区如广州、玉林等地，其土壤、水质均存在不同程度的隐性重金属污染[13]。地龙独特的生活习性，使其极易受到土壤环境的影响，尤其是对部分重金属具有自然富集作用，对人体可能存在潜在健康威胁。但有研究证明，地龙中有害元素的风险并不完全取决于有害元素的总量，而是取决于各元素在机体中化合的价态[14]。然而，机体中金属元素的结合状态大多数是未知的，因此只有对其进行结合态以及结合物的毒理研究，才能做出准确的风险评估。目前，只能从养殖方面入手，加强土壤、水质、饲料管理，尽量减少地龙的重金属污染。