色选分级技术在通渭金银花质量等级划分上的应用研究

郭然，代熙，黄厚钰，韦智江，翟玉生，陈耀，李卫东*（. 北京中医药大学中药学院，北京 0488；. 通渭县清凉沅金银花产业扶贫开发有限公司，甘肃 定西 743300）

随着新型冠状病毒肺炎疫情在全球蔓延并加重，抗疫成为全人类面临的重要问题。越来越多的临床证明，以“三药三方”为代表的中药在这场抗疫中发挥了重要作用，尤其是连花清瘟胶囊、金花清感颗粒[1-2]，金银花是这两种药物的主要成分药材。金银花质量严重影响药物的临床疗效，其质量控制对人类大健康需求以及金银花产业发展至关重要[3]。研究表明，金银花花蕾的发育程度不同其颜色不同，对应药材的药效成分含量会有差异，两者呈一定相关性[4]，这为金银花的色选分级提供了理论依据。色选分级技术已在茶叶、蔬菜等领域广泛应用，物料进入色选机的第一层分选室后，从传感器和背景板间穿过，在光源的作用下，传感器接收颜色信号，经处理后产生输出信号，驱动喷阀工作，将枝叶等异物吹至背部接料斗内流走，其余物料继续下落，经过第二层分选室再次分选后至出料口流走，达到对物料精选和分级的目的[5]。能否通过颜色差异应用色选分级技术进行金银花质量等级划分，是本研究关注的主要问题。自2013年以来，北京中医药大学金银花研究团队在通渭县的11 个乡镇，完成了从金银花北花一号新品种[6-7]的试种、中试，到2000亩示范和大面积推广过程。至2020年，已累计推广种植金银花10 万亩，金银花产业成为了当地的经济支柱产业。

本研究以经色选机分级后的通渭金银花为材料，运用现代质量评价手段和多元统计分析方法，验证通渭金银花色选分级技术的科学性，为色选分级技术在金银花产业中的推广和应用提供理论依据。同时，制订通渭金银花质量等级标准，为其产业发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品收集

样品分别采自甘肃省定西市通渭县11 个乡镇，经北京中医药大学李卫东研究员鉴定为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或带初开的花。色选机分级为特级、一级、二级和三级，产地加工方式为烘干。样品共计44份，详细信息见表1。

表1 金银花样品信息Tab 1 Information of Lonicerae Japonicae Flos

1.2 试药与仪器

绿原酸（批号：MUST-17030620）、异绿原酸C（批号：MUST-15081414）、木犀草苷（批号：MUST-17030405）（成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均≥98%），异绿原酸A（批号：Z05M10X87215）（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%），乙腈[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，甲醇、乙醇（分析纯），水为娃哈哈矿泉水。

6CSX-300IIIA（TD3）型人工智能色选机（合肥美亚光电技术股份有限公司），CBM-20A型岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司），KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），1/10 万电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，粉碎机、马弗炉、电热套、HH-S4A 型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.3 金银花外观性状检测

以色泽、黄条、开放花、黑头、黑条、枝叶含量等指标对金银花的外观性状进行量化表征[8]。从每份样品中随机称取10 g 金银花，分离出黄条、开放花、黑头、黑条、枝叶等部分，称定质量（精确至0.01 g）。由于开放花、黑条数量极少，故分别与黄条、黑头指标合并表征。分别计算以上各部分质量分数，可得到黄条（含开放花）率、黑头（含黑条）率和枝叶率。色泽用连续排列正整数 1，2，3……进行编码，对纯青花不含黄条者赋值“1”；花浅绿含极少黄条者赋值“2”；花浅绿含较多黄条者赋值“3”；花黄或色难辨者赋值“4”[9]。

1.4 金银花主要活性成分含量测定

按2020年版《中国药典》金银花【含量测定】项下方法检测样品中酚酸类和木犀草苷成分含量，其中酚酸类成分包括绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（异绿原酸A）和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（异绿原酸C）[10]。

1.5 金银花常规理化指标测定

按 2020年版《中国药典》金银花【检查】项下规定方法检测样品中的水分、总灰分和酸不溶性灰分[10]。

1.6 数据处理与分析

采用IBM SPSS Statistics 26 统计分析软件对金银花样品外观性状、主要活性成分含量和常规理化指标进行描述性统计分析和相关性分析，筛选出与等级和活性成分显著相关的指标，进行系统聚类分析以验证色选机分级的合理性；最后对所有指标进行K-均值聚类分析。

2 结果与分析

2.1 金银花外观性状、主要成分及理化指标检测结果

图1 为产自通渭县李店乡的金银花色选等级图，对应表1 的样品编号为“5 ～8”。44 份金银花外观性状、酚酸类、木犀草苷含量及水分、总灰分和酸不溶性灰分含量测定结果，见表2。

表2 金银花外观性状、主要成分及常规理化指标测定(%)Tab 2 Determination of appearances，main components and physical and chemical indexes of Lonicera japonica Flos (%)

图1 通渭李店乡金银花色选等级图Fig 1 Color grading picture of Lonicera japonica Flos

2.2 金银花各项指标描述性统计

对44 份金银花样品的上述各指标进行描述性统计分析，并计算变异系数，结果见表3。各项指标的变异系数在4.58%～104.87%，除总灰分变异系数为4.58%外，其余各项指标的变异系数均＞10%，表明除总灰分外，其余各项指标在44 份金银花样品间存在较大差异。

表3 金银花各项指标描述性统计分析Tab 3 Descriptive statistics for various indexes of Lonicera japonica Flos

2.3 相关性分析

对44 份金银花样品的色选等级与除总灰分外的11 项指标进行皮尔逊相关性检验，结果见表4。除酸不溶性灰分外，其余指标与色选等级的相关性有统计学意义。其中外观性状指标、水分和木犀草苷与色选等级成极显著正相关，酚酸类指标含量与色选等级成极显著负相关。因此将上述4 项外观性状指标和5 项成分含量指标及水分作为系统聚类分析的变量，以验证色选机分级结果的科学性。

表4 金银花有效指标与商品等级的相关性分析Tab 4 Correlation analysis of effective index and commodity grade of Lonicera japonica Flos

进一步对4 项外观性状指标和5 项成分含量指标进行皮尔逊相关性检验，结果见表5。色泽、黄条（含开放花）率和黑头（含黑条）率与酚酸类成分含量成极显著负相关，与木犀草苷成极显著正相关。即随着色泽变黄，黄条（含开放花）率和黑头（含黑条）率升高，酚酸类成分含量降低，木犀草苷含量则会升高。枝叶率与4 种成分含量均没有显著性相关关系。分析造成木犀草苷与外观性状成负相关的原因，可能与金银花中黄酮类成分随着金银花的发育呈现先上升后下降的趋势有关[11]。而枝叶率与成分含量没有显著相关关系，主要是因为所取样品中枝叶含量极低，表明色选机能较好地将枝叶从金银花药材中分离出来。上述结果表明，金银花的外观性状在一定程度上可以反映其内在质量，故色选机通过判定金银花外观性状从而对其进行分级，具有科学性。

表5 金银花有效成分含量与外观性状指标的相关性分析Tab 5 Correlation between the content of effective components and appearance of Lonicera japonica Flos

2.4 系统聚类分析

以上述4 项外观性状和5 项成分含量及水分指标为变量，以44 份样品标准化处理后的数据为个案，采用质心聚类法，余弦度量标准，进行系统聚类分析，得样品聚类谱系图，见图2。将44 份样品归为4 类，Ⅰ类样品11 份（编号：32、40、16、8、28、4、20、12、44、24、36）， 参考表1 对照编号可知11 份样品均为三级；Ⅱ类样品8 份（编号：7、23、19、31、11、43、35、39），均为二级；Ⅲ类样品11 份（编号：1、5、25、29、21、33、9、17、37、13、41），均为特级；Ⅳ类样品14 份（编号：22、26、2、6、30、34、10、42、14、27、18、38、3、15），其中一级11份，二级3 份，一级占比78.57%。一级和二级存在部分交叉现象，但相同等级归为同一类别的样品数占总样品数的93.18%。由此可见，用色选机对金银花进行等级划分具有高度可行性。

图2 44 份金银花样品的系统聚类分析树状图Fig 2 Tree view by hierarchical cluster analysis with 44 samples of Lonicera japonica Flos

2.5 通渭金银花质量等级标准划分

本研究对通渭金银花的色泽、黄条（含开放花）率、黑头（含黑条）率、枝叶率、绿原酸、木犀草苷、总酚酸、水分、总灰分和酸不溶性灰分10 项指标进行等级标准划分。并以除色泽外的其余9 项指标为变量，44 份样品标准化处理后的数据为观测值，进行K-均值聚类分析。目前市场上通常将金银花划分为3 个等级或4 个等级[12]，由上述分析发现，若将金银花分为4 个等级，部分相邻两个等级的指标观测值较为接近，不易区分，并且用色选机进行色选时分4 级比分3 级费时费工。故为节约成本和更好地实现“优质优价”，本标准将金银花质量等级划分为3 个级，即将K-均值聚类结果规定为3 类。方差分析和聚类结果见表6 及表7。由方差分析可知枝叶率和酸不溶性灰分等级间差异未达到显著性水平，故仅作为参考指标列出。根据K-均值聚类分析所得最终聚类中心，对通渭金银花制订质量等级标准，结果见表8。

表6 金银花等级相关主要指标K-均值聚类方差分析Tab 6 Variance on K-means clustering of main indexes related to Lonicera japonica Flos grade

表7 金银花等级相关主要指标最终聚类中心Tab 7 Final cluster center of main indexes related to Lonicera japonica Flos grade

表8 通渭金银花质量等级标准划分建议表Tab 8 Suggestion for classification of grade quality standard of Lonicera japonica Flos in Tongwei

3 讨论

金银花作为传统大宗中药材，在市场上一直遵循“按质论价、优质优价”的原则。因此，采用科学合理的分级方法对金银花产业的发展尤为重要。目前常用的金银花分级方法为传统人工分级法。传统的辨状论质，从感官上对金银花进行等级划分的方式，不仅要求分辨者具有极强的专业能力，而且效率较低，这严重阻碍了金银花产业的发展进程。色选机的出现，较好地解决了这一问题。研究发现，色选机在茶叶、种子、水果和蔬菜的分级或清选中广泛应用，且清选和分级作用非常明显，且色选机根据茶叶和茶梗之间的色差即可对茶进行较好的分级[5，13]。综上，色选机是一种根据颜色来对物料进行分选的设备。

金银花外观颜色性状与其质量之间存在相关性。熊吟等[14]通过研究金银花有效成分含量与颜色值L*之间的相关性发现，L*在 43.1% 的程度上受绿原酸、木犀草苷、总黄酮 3 个有效成分影响。王玲娜等[11]通过探索不同发育时期金银花颜色和每个花蕾活性成分量的相关性发现，金银花的颜色与活性成分量密切相关，且酚酸类、黄酮类化合物量在二白期（花蕾绿色）、大白期（花蕾绿白色）最高。杨晓芸[4]经研究发现，绿原酸、木犀草苷、多酚类、叶绿素含量高低关系为：绿色＞黄绿色＞绿白色＞黄白色＞黄色。这均揭示了传统认为金银花为绿色的质量较好、黄色的质量较差的科学内涵。本研究认为，以金银花外观颜色性状为依据进行色选分级具有科学性。

质量等级标准的制订是金银花色选分级的基础。周洁等[15]以39 份全国不同产区的金银花为样品进行质量等级标准研究，并将金银花划分为4 个等级，规定绿原酸含量一等≥2.04%、二等≥2.06%、三等≥2.49%、四等≥1.50%；木犀草苷含量一等≥0.07%、二等≥0.05%、三等≥0.05%、四等≥0.07%。张欢等[16]以采自封丘、平邑、巨鹿三大主产区的34 份金银花为研究对象，进行等级标准划分，规定绿原酸含量一等≥2.89%、二等≥2.53%、三等≥1.98%、四等≥1.51%；木犀草苷含量一等≥0.078%、二等≥0.072%、三等≥0.068%、四等≥0.052%。冯峰等[12]以2020年版《中国药典》为依据，并结合采自21 个不同产区的金银花样品检测结果，建议将金银花质量等级标准划分为3 个等级，其中绿原酸含量一等≥2.30%、二等≥1.80%、三等≥1.50%；3 种酚酸总含量一等≥4.20%、二等≥4.00%、三等≥3.80%。本研究发现，通渭县栽植的金银花主要药用成分绿原酸和木犀草苷含量高出药典规定的2 ～3 倍。究其原因，可能与当地土壤疏松适宜，日照充足，昼夜温差大，土壤、空气、水资源污染程度低等优势地理条件有关[17]。

4 结论

通过对采自通渭11 个乡镇的44 份金银花样品进行测定与分析，结果证明用色选机对金银花进行等级划分具有可行性。同时，制订通渭金银花质量等级标准，所制订的通渭金银花等级标准要求较高。这将推动通渭金银花走向行业前端，并促进其国际化贸易发展进程。