头针联合中药对缺血性脑卒中失眠大鼠模型p38MAPK浓度的作用*

张 野，丛德毓，汲广成，王宇峰，娄惠娟，张红石△

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林省中医院，吉林 长春 130021；3.长春中医药大学附属第三临床医院，吉林 长春 130117)

缺血性脑卒中后失眠是临床常见疾病，缺血性脑卒中患者中有较多患者在不同程度上会出现失眠[1]。据流行病学统计卒中后患者失眠发病率为48.67%～68%，相对于正常人群中的失眠发生率是显著升高的[2]，失眠是影响卒中治疗和恢复的主要障碍，而且可能会增加卒中的复发率和死亡率，同时也会相继出现抑郁倾向，所以失眠与脑血管病变密切相关。

大鼠P38丝裂源活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化后可被激活，参与炎症、应激反应和细胞凋亡等，是机体众多细胞转导通路的中转站，是各类炎症反应以及神经突触传递信号作用的重要激酶[3]。与坐骨神经损伤、褥疮组织坏死、痴呆、失眠和促进肿瘤细胞凋亡等发生机制有关[4]，对脑损伤后各类疾病的影响值得进一步研究。有研究表明p38MAPK在阿尔茨海默症血液与疾病持续时间呈正相关,且在大脑与学习、记忆和睡眠相关区域中高度表达[5]。在各种失眠动物模型中也仅证实了p38MAPK参与Aβ诱导的神经元损伤的证据，p38MAPK活性在失眠的病理发展中起着重要作用，抑制认知神经元细胞中p38MAPK的激活是失眠的治疗途径之一[6]。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)属于星形胶质细胞变化的标记物，受应激反应变化，脑损伤后一般表达增加，具有促进轴突再生和神经重构的功能，同时也介导神经活性物质相关的多种炎性细胞因子变化，如TNF-α、GFAP可能是诱导p38MAPK变化的通路之一[7]。β-内啡肽(β-EP)是人体一种具有止痛、镇静作用的物质，有研究认为睡眠剥夺会导致β-EP表达水平下降，β-EP与GFAP常被用于神经应激反应一类的研究[8]。

1 实验材料

1.1 动物及分组

从长春市亿斯实验动物技术有限公司购买SD大鼠30只，体质量220～230 g，进入长春中医药大学实验动物中心饲养，随机分3组，每组10只，其中两组进行脑卒中后失眠造模，随机选择1组作为头针联合中药组进行头针和中药治疗，另一组作为模型组不治疗，未造模一组作为空白组，饲养间保持温度为23 ℃、12/12 h光照周期，温度(55±10)%，并自由饮水。实验已通过长春中医药大学伦理委员会审批(20190151)。

1.2 主要仪器及试剂

Morris水迷宫视频跟踪分析系统(北京众实迪创科技发展责任有限公司)；视频分析系统Smart version3.0.04；华佗牌一次性针灸针(0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品有限公司)；大鼠P38MAPK酶联免疫检测试剂盒96T(血清、血浆)(南京建成)；大鼠β-EP酶联免疫检测试剂盒96T(组织匀浆)(南京建成)；大鼠GFAP酶联免疫检测试剂盒96T(血清、血浆)(南京建成)；大鼠P38MAPK酶联免疫检测试剂盒96T(血清、血浆)(南京建成)；组织匀浆器(美国KONTES)；低温高速离心机(德国Eprendorf);Biotek Synergy HTX多功能微孔板检测仪(biotek宝特伯腾)；10%水合氯醛(北京试剂公司)。

2 实验方法

2.1 缺血性脑卒中模型的建立

采用大脑中动脉栓塞灌注造模法，术前24 h大鼠停止喂养但是可以饮水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，确保全程无痛。大鼠仰卧固定后消毒。在颈部正中纵切一小口，钝性分离组织和腺体，拨开肌肉可见左侧颈总动脉，分离左侧颈内动脉和颈外动脉，挂线备用，结扎颈外动脉。再结扎颈总动脉，夹闭颈内动脉。在颈总动脉上距离分叉2 mm处剪一斜口，插入线栓，轻提颈内动脉缝合线并松开颈内动脉血管夹，沿颈内动脉将线栓穿过颅骨直至手下有明显阻力时(约18 mm)，实现大脑中动脉阻塞，导致脑缺血。以缝合线结扎切口并固定住线栓，剪断多余部分缝合线，缝合伤口后，给予大鼠注射青霉素20万单位防止感染，完成造模。造模后随即进行神经功能评分。

2.2 卒中后失眠模型的建立

采用失眠动物模型PCPA法造模，卒中模型成功后1 d，腹腔注射400 mg/kg的PCPA悬浊液2 mL，1次/d，连续注射2 d。大鼠出现昼夜节律紊乱，对外界敏感，第3天中午腹腔注射戊巴比妥钠35 mg/kg，翻正反射试验消失为成功。

2.3 干预方法

中药选用益脑复健方，出自《成方制剂》，为国医大师任继穴创立[9]，临床应用广泛，方由赤芍、川芎、蒲黄、葛根、槐花、地龙、红花、豨莶草和三七组成，该方可以活血散瘀、行气醒神，药效和缓而少有副作用，适用于中风后缓解期局部脑组织缺血后诸证。头针是取用脑的顶区及顶前区，参考于致顺教授头针丛刺理论，结合《大鼠穴位图谱》[10]在顶骨正中的百会穴及旁开5 mm处进行定位取穴。

联合组在造模成功后，首先以益脑复健方中药灌胃，按照成人1/30的比例用量，以赤芍、川芎、蒲黄、葛根、槐花、地龙各20 g,红花12 g,豨莶草30 g,三七18 g，加适量水熬2 h，剩余药液300 mL。给药时每只大鼠灌胃5 mL。头针治疗在灌胃后进行，先取百会穴，以针灸针(0.25 mm×13 mm)向前斜刺10 mm，再在百会穴两侧旁开约5 mm处，沿皮朝鼻尖向前斜刺10 mm，进针后以捻转方式快速行针30 s，以小块医用胶布(5 mm×10 mm)固定，采取丛刺法和长留针的方式，放入无垫料笼中，配合带针运动，留针6～8 h，1次/d，每周针刺5次，持续2周。

2.4 大鼠行为学检测

Morris水迷宫试验：用于测试大鼠的复杂记忆能力和空间定位能力。水迷宫(ZS-001moriss)由1个圆柱形水槽和图像采集分析系统构成(DIGITAL CCD CAMERA)，四周围有遮光帘，从而减少外界干扰，利用动物求生本能，寻找隐藏水中的平台，记录每只大鼠所需要的时间和路线。

2.5 血清和脑组织中p38MAPK浓度测定

在治疗周期结束后，分别将空白组、模型组和联合组的大鼠以10 %水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，确保大鼠肌肉放松并且无痛，剪开腹腔，腹主动脉取血5 mL，并将血样本离心(2 000×g，4℃、15 min)，离心后获得上层血清。大鼠处于麻醉状态，取血后断头处死，立即剥离脑组织，脑样本按重量体积比1 g∶9 mL的比例加入9倍体积的磷酸盐缓冲液(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本充分匀浆并离心(2000×g，4 ℃、15 min)，收集上清液体备用。采用ELISA法检测大鼠血清及脑组织p38MAPK、β-EP和GFAP含量，严格按照试剂盒说明书步骤进行实验。

2.6 统计学处理

采用SPSS24.0软件对所有结果进行统计处理，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，治疗前后对比采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 建模结果

建模后大鼠具有正常生命体征，皆未出现腹膜炎迹象，观察各组大鼠造模前后的行为学变化，水迷宫测试结果显示造模前3组差异无统计学意义，造模后两组与空白组比较具有统计学意义(P<0.05)，提示造模成功。见表1。

表1 各组大鼠造模前后水迷宫测试时间比较

3.2 各组大鼠p38MAPK浓度比较

大鼠血清中p38MAPK浓度结果显示，空白组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；联合组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。大鼠脑组织中p38MAPK浓度结果显示，空白组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清与脑组织内p38MAPK比较

3.3 各组大鼠血清中β-EP、GFAP浓度比较

大鼠血清中β-EP浓度结果显示，空白组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；联合组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。大鼠血清中GFAP浓度结果显示，空白组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，联合组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中β-EP、GFAP浓度比较

3.4 治疗2周后大鼠行为学功能比较

观察3组大鼠在治疗前后的行为学变化。水迷宫测试结果显示联合组在治疗前后比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，治疗后模型组分别和空白组、联合组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，如表4。治疗后模型组、空白组和联合组大鼠行为学路线比较，如图1。

表4 各组大鼠治疗前后水迷宫测试时间比较

图1 各组大鼠治疗后水迷宫测试路线比较

4 讨论

缺血性脑卒中后的失眠是脑卒中的重要并发症，是脑动脉梗死而引起的脑组织缺血和缺氧而导致，尤其以老年患者或有失眠病史者发病率高，《黄帝内经》寒热病篇记载:“足太阳有通顶入于脑者……入脑乃别阴迹、阳迹，阴阳相交，阳入阴出，阴阳交于目锐眦，阳气盛则瞋目，阴气盛则瞑目”，论述了头和睡眠障之间的密切联系。在《黄帝内经》营卫生气篇中也论述:“肌肉枯，气道涩，五脏之气相抟，其营气衰少而卫气内伐，故昼不精，夜不瞑”，强调了肢体经脉不通或津液不足会对睡眠造成影响，临床上卒中后痉挛患者往往出现失眠或者焦虑症状，而针刺和中药属于传统的常用方法，临床联用疗效显著，有实验表明针灸和中药可以抗血栓、保护血管，能够对血管内皮组织细胞产生影响[11]，从而促进血管内皮再生和重塑，增加侧支循环。长白山通经调脏手法流派依据学术经验和现代研究理论，采用头针联合中药的治疗方案进行治疗，一方面用中药改善脑部血液循环，行气化瘀，调节血管内皮细胞，促进血管再生，增加脑内氧供给量，另一方面以头针疏通头部经脉，着重镇静安神，调节脑内气血逆乱，从而达到治神与调形兼顾的效果，应用较广，临床观察研究效果确切，在作用机理方面仍然缺乏足够认识。

头针联合中药治疗方案是基于长白山活血通经的传统治疗原则和脑缺血后的血管再生保护机制而确立，血管再生是通过血管内皮细胞的分化增殖转运、重组分裂而形成新的血管网络，从而改善局部血液循环和血氧供应，与中医的活血通经理论具有一致性[12]，在以往的临床治疗中具有良好疗效，但是缺少理论机制的研究。脑卒中是由于大脑动脉突然闭塞而导致的脑血流减少，脑组织由于循环不足、缺少氧气以及能量不足而导致神经元、胶质细胞和内皮细胞等功能损害，致使失眠等一系列病变[13]。基于《灵枢》“头有气街”论述，中医学认为“头气有街”，头气源于自身经络之气血，是头部重要的血气之道，张景岳也认为:“头面为人之首，凡周身阴阳经络无所不聚，故气血皆上行头面而走诸窍”。所以结合缺血性脑卒中与头气街的联系，应用头针的方法对卒中后失眠进行治疗。治疗脑卒中失眠主要选取顶区和顶前区以及额区，并以头部的重要经脉督脉作为纵向维度基准，既符合头针分区理论又兼顾通督调神的理念。中药选取赤芍、红花、川芎和三七化瘀通络、缓急消肿；蒲黄、槐花和豨莶草平肝祛风、清厥阴热，现代药理研究发现赤芍、川芎、葛根和地龙皆不同程度上具有解痉镇静的作用。故依据临床实践对于卒中后失眠的治疗，并进行对脑卒中后失眠大鼠模型治疗的实验，结合p38MAPK等相关物质探索其作用机制。

p38MAPK是细胞内信号转导通路中重要的物质，能够参与多条生物刺激信号通路发生，在脑组织损伤中参与细胞凋亡的物质[14]，在与海马结构相关的中枢系统中p38MAPK与学习、记忆和睡眠功能相关[15]，在海马区域高度表达，尤其血管痴呆后大鼠脑内p38MAPK升高[16]，可能是与学习、记忆和睡眠相关细胞生长、凋亡炎症或反应应激过程的关键信号[17]。实验结果表明，模型组的血清内检测p38MAPK浓度高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.01)。造模后模型组的脑组织内p38MAPK浓度高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，大鼠血清中β-EP浓度结果显示，空白组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；联合组治疗后与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；大鼠血清中GFAP浓度结果显示，空白组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，联合组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明脑卒中后失眠大鼠模型的血液及脑组织中p38MAPK浓度皆受到影响，且与之有关的β-EP、GFAP两种物质在血清中也相应变化，从而改善睡眠。Wen LiFang关于p38MAPK参与Aβ诱导神经元损伤的研究认为脑组织中Aβ大量聚集，会诱导细胞毒性，从而导致一系列信号通路紊乱。杨申[18]认为p38MAPK在细胞凋亡信号转导中发挥重要作用，其被磷酸化激活后调节基因转录，诱导p38-caspase-3促进凋亡通路，可以改善其学习记忆能力下降。有研究也证明p38MAPK是导致失眠发生的物质之一,且相关通路具有促进神经元生长作用[19]。有研究发现[20]p38MAPK可影响VD大鼠学习记忆能力。治疗后联合组血清内p38MAPK浓度低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)，联合组脑组织内p38MAPK浓度低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明头针联合中药的方案能够通过干预p38MAPK从而恢复卒中后大鼠失眠。

5 结论

综上,大鼠脑组织和血清内p38MAPK浓度升高与大鼠缺血性脑卒中的失眠发生相关，大鼠血清和脑组织内p38MAPK相关通路参与卒中大鼠睡眠恢复过程，头针联合中药的治疗方案可以促进卒中后失眠大鼠模型血清及脑组织内p38MAPK的浓度降低，可能是促进修复受损伤大鼠模型的空间记忆能力和睡眠功能的重要因素。