脊髓损伤患者血清神经营养因子、炎症因子及Bcl-2/Bax的表达

张子亮，黄凯华，吴晓曙，吴志浩，王贯通，孙强(南京医科大学附属南京医院骨科，南京 210001)

脊髓损伤是一种常见的、高致残率的中枢性神经系统损伤性疾病，临床主要表现为感觉及四肢运动功能障碍伴自主神经功能紊乱，对患者的生活质量产生严重的影响[1]。研究发现，急性脊髓损伤后神经营养因子的缺乏及炎症反应是影响神经功能恢复及神经再生的重要因素[2]。此外，凋亡也常发生在脊髓损伤过程中，研究证实，B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)/Bcl-2相关的X基因(Bax)作为主要的凋亡基因家族成员，可以调控神经细胞的凋亡[3]。然而，国内关于急性脊髓损伤患者血清神经营养因子、炎症因子及凋亡相关分子表达水平动态变化的报道少见。因此，本研究拟采用ELISA法检测脊髓损伤患者在损伤1、3和7 d后血清脑源性神经营养因子(brain-derived nurotrophic factor, BDNF)、神经营养因子3(neurotrophin-3,NT-3)、NT-4、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及血清Bcl-2、Bax的表达水平，分析其在急性脊髓损伤过程中变化水平及临床意义，以期为该病的临床诊治提供实验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年4月至2019年6月南京市第一医院脊柱骨病外科就诊的48例脊髓损伤患者作为研究对象，男 31 例，女 17 例，年龄(48.12±4.58)岁。纳入标准：(1)符合美国脊髓损伤协会的Frankel分级标准[4-5]；(2)近期未使用镇痛消炎及抗菌药物者；(3)影像学资料显示，相应关节存在一定程度损伤；(4)患者及家属知情同意。排除标准：(1)合并免疫系统、癌症及中枢神经系统疾病者；(2)合并严重感染及过敏性疾病者；(3)合并肢体残疾及神经系统疾患者；(4)合并有肝炎、梅毒等严重传染性疾病者；(5)依从性差，中途退出者。根据神经功能分级将其分为完全损伤组(n=21，完全性脊髓损伤)和不完全损伤组(n=27，不完全性脊髓损伤)。完全损伤组患者男14例，女7例，年龄(48.36±4.51)岁，其中胸腰椎骨折12例，颈椎骨折9例，跌落伤9例，重物砸伤5例，车祸伤3例，高处坠落4例；不完全损伤组患者男17例，女10例，年龄(48.12±4.60)岁，其中胸腰椎骨折16例，颈椎骨折11例，跌落伤12例，重物砸伤6例，车祸伤4例，高处坠落5例。2组患者在年龄(P=0.857)、性别(P=0.790 )、骨折部位(P=0.882)及损伤原因(P=0.950)等一般资料间的差异无统计学意义，具有可比性。另取同期体检健康者30例作为健康人对照组，其中男18例，女12例，年龄(47.92±4.65)岁。

1.2主要仪器及试剂 ID-Centrifuge 12 S Ⅱ型台式离心机(北京东方珠峰生物技术开发公司)，全自动酶标仪(烟台澳斯邦生物工程公司)。血清BDNF、NT-3、NT-4、IL-6、TNF-α及Bcl-2、Bax酶联免疫吸附反应试剂盒 (上海信裕生物技术公司)。

1.3样本采集 所有受试者均在脊髓损伤后24 h内入院，并立即对于患者均给予营养神经、脱水、激素等基础性治疗，根据患者致压物部分及脊柱骨折类型等因素，对严重神经功能缺损患者进行相应的高压氧治疗。在脊髓损伤治疗后 1、3及7 d时采用EDTA-K2抗凝管采集各患者(体检健康者于体检时采集)空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-80 ℃保存。

1.4方法 取上述血清样本，采用ELISA法，按照BDNF、NT-3、NT-4、IL-6、TNF-α及Bcl-2、Bax酶联免疫吸附反应试剂盒说明书进行检测。使用全自动酶标仪在450 nm波长下测定血清样本中各指标的吸光度A值，在EXCEL软件中根据A值绘制标准曲线，并计算各指标在血清中的具体浓度。

2 结果

2.1脊髓损伤后各组患者血清BDNF、NT-3、NT-4的表达水平 3组受试者在脊髓损伤后1、3、7 d时的血清BDNF、NT-3和NT-4水平呈现逐渐降低的趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)；进一步进行组间两两比较，结果发现完全损伤组在脊髓损伤后1、3、7 d时血清BDNF、NT-3和NT-4水平均显著高于不完全髓损组，见表1。

表1 脊髓损伤后各组患者血清BDNF、NT-3、NT-4的表达

2.2脊髓损伤后各组患者血清炎症因子的表达水平 与健康人对照组相比，各组受试者血清IL-6和TNF-α水平在脊髓损伤1 d后明显升高，且在脊髓损伤3 d后达到峰值。与健康人对照组相比，完全损伤组、不完全损伤组患者血清IL-6水平逐渐下降(P<0.05)，见表2。

表2 各组患者脊髓损伤后血清IL-6和TNF-α水平变化(ng/mL)

2.3脊髓损伤后各组患者血清凋亡因子的表达水平 与健康人对照组相比，完全损伤组、不完全损伤组患者在脊髓损伤1、3、7 d后血清Bcl-2水平逐渐降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。而完全损伤组、不完全损伤组患者在脊髓损伤1、3、7 d后血清Bax水平逐渐升高，差异具统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组患者脊髓损伤后血清Bcl-2和Bax水平变化(ng/mL)

3 讨论

BDNF是体内含量最多的神经营养因子之一，有学者发现，BDNF在脑缺血和阿兹海默症患者中的表达水平显著升高，并且可以有效改善神经元损伤的程度[4]。本研究通过动态检测脊髓损伤患者血清BDNF的表达水平，结果发现其表达水平较健康人对照组呈现明显升高的趋势。此外，NT-3和NT-4也被证实在患者脊髓损伤后具有促进神经元分化、神经干细胞增殖以及体内脊髓轴突长距离生长的作用。笔者通过ELISA法检测证实，NT-3和NT-4在脊髓损伤恢复过程中的作用显著，且与脊髓损伤程度存在一定的相关性。而黄建华等[5]的研究亦证实，未接受治疗且在脊髓损伤48 h内患者血清NT-3和NT-4的表达水平显著升高，与本研究结果类似。提示在脊髓损伤后尽早采取神经营养治疗措施以改善患者脊髓损伤的预后。

脊髓损伤后的神经炎症水平是反映神经损伤及神经功能紊乱程度的重要因素。研究表明，持续性的强神经炎症刺激会对脊髓组织造成大范围继发性损伤[6]。本研究动态检测了脊髓损伤1周内受试者血清中炎症因子的水平变化，发现损伤组血清TNF-α和IL-6水平明显高于健康人对照组，提示炎症是脊髓损伤后重要的病理过程。Bax和Bcl-2均属于Bcl-2家族成员，两者可对细胞凋亡进行调控，其中Bcl-2可以通过与Bax形成异源二聚体以进行凋亡抑制，从而实现对Bcl-2蛋白抑制凋亡的对抗效果[7]。笔者对患者脊髓损伤后1周内的血清Bax和Bcl-2进行检测，发现血清Bcl-2水平显著高于健康人对照组，而血清Bax水平显著低于健康人对照组。此外，除不完全损伤组血清Bax的表达水平在1周内各个时间点高于完全损伤组外，其他各项指标均为完全损伤组更高，提示上述神经营养因子、炎症因子以及凋亡因子可能作为脊髓损伤程度的评价指标。

然而，本研究只将治疗后的脊髓损伤受试者和健康人对照组进行比较，并未纳入未治疗组进行进一步的对比；其次，笔者在1周内只选取了3个时间点进行对比，各指标的动态变化可能并不能够完全反映患者脊髓损伤的实际情况。后续的研究中，我们将纳入未治疗的受试者并更加细化的时间点进行采样。综上所述，急性脊髓损伤患者血清神经营养因子、炎症因子及Bcl-2水平均明显升高，Bax水平显著降低，其水平变化可作为临床判定脊髓损伤程度的参考指标，但需根据患者病情进一步分析。