汉族健康妊娠妇女HLA-G 3′UTR基因多态性及单倍型的分布特征*

白 微，叶 瑾，奚经巧，2，林 枝，蔡文品，2△

(浙江中医药大学附属温州中医院：1.检验科；2.中医药科研实验中心，浙江温州 325000)

人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)位于人类第6号染色体短臂上，是一群紧密连锁基因群，属于人类非经典的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子。HLA-G包括编码区和非编码区(untranslated region，UTR)，HLA-G 3′UTR富含AU的基序，聚腺苷酸信号和微RNA(microRNA，miRNA)结合位点，不同于编码区的低多态性，UTR呈现出高度的多态性。HLA-G 3′UTR的基因多态性与HLA-G表达的转录后调控有关，该区域约有30个多态性位点[1]，研究最多的是14 bp插入/缺失，与HLA-G mRNA的稳定性有关[2]。其他的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点还有+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G等，被证实与mRNA降解和miRNA结合有关[2]。正常生理条件下，HLA-G分子仅在母胎界面的绒毛外滋养层细胞、胸腺、胰岛及间充质干细胞等少数免疫豁免组织表达[3]。HLA-G特异性高表达于绒毛外滋养层细胞，参与母胎界面免疫耐受的诱导和维持[4]，许多研究表明HLA-G基因多态性与复发性流产、先兆子痫等病理妊娠有较大相关性[3]。HLA-G 3′UTR基因多态性与妊娠相关的研究多集中在14 bp插入/缺失，其他位点的研究甚少，且有研究表明不同地区不同种族人群HLA-G 3′UTR基因多态性存在异质性[5]。因此，本研究分析了本地区HLA-G 3′UTR多个位点在健康妊娠妇女中的分布特点，为本地区健康妊娠妇女HLA-G 3′UTR基因多态性的分布提供试验数据，为后续妊娠相关疾病的研究打下基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年10月至2018年10月本院产前检查妇女168例，年龄18～41岁，平均(27.1±4.3)岁，均为汉族，无高血压、糖尿病、肾脏疾病等基础疾病，无糖尿病、高血压等妊娠期并发症。所有孕妇均签署知情同意书，本研究获得本院伦理委员会批准(批准号：WTCM-H-2017035)。

1.2 方法

1.2.1样品采集与处理

平静状态下选取合适的肘静脉，用美国BD公司生产的采血管采集乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝全血2～3 mL，-80 ℃保存，用于血液全基因DNA提取。

1.2.2外周血液全基因DNA提取

采用天根生化科技(北京)有限公司生产的全基因组DNA提取试剂盒提取血液全基因DNA，所有操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。用NanoDrop One核酸浓度分析仪测定提取的DNA浓度和纯度。

1.2.3HLA-G 3′UTR基因PCR扩增

利用Primer Premier5.0软件进行PCR引物设计，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列HLA-G-3′UTR正向：5′-GTG GGT TGT TGA GGG-3′；HLA-G-3′UTR反向:5′-GTC TTC CAT TTT TGT CTC T-3′，扩增产物500 bp。根据PCR试剂说明书调整扩增条件，采用25 μL体系Taq MasterMix 13 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，双蒸水(ddH2O)8 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃长延伸10 min，步骤变性-步骤延伸进行35个循环。

1.2.4PCR扩增产物电泳

配制1.5%琼脂糖(上海Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇贸易有限公司)凝胶，Goldview染色(北京索莱宝科技有限公司)，将PCR扩增产物上样，120 V恒压电泳15 min，凝胶成像仪拍照记录。检测扩增产物，500 bp处出现亮带表明扩增成功，进行下一步测序。

1.2.5Sanger测序

将PCR扩增产物送至杭州擎科生物技术有限公司进行Sanger测序，测得的序列利用CodonCode Aligner软件比对分析，确定基因型。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0统计软件进行Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验，P>0.05表示处于H-W平衡；SHEsis在线软件直接统计基因型和等位基因频率，进行连锁不平衡分析和单倍型分析。

2 结 果

2.1 H-W平衡检验

HLA-G 3′UTR 8个多态性位点H-W平衡检验结果见表1，结果显示，14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G 8个位点的分布均符合H-W平衡(P>0.05)，该人群处于H-W平衡状态，样本具有本区域群体代表性。

表1 HLA-G 3′UTR基因多态性位点H-W平衡检验

2.2 HLA-G 3′UTR基因型与等位基因频率分布

8个多态性位点基因型和等位基因频率分布见表2，结果显示，14 bp ins/del位点以del等位基因和del/del基因型为主，占比分别为81.0%和65.5%；+3003C/T位点T等位基因和TT基因型占大多数，占比分别为99.4%和98.8%，未发现CC基因型；+3010G/C位点以G等位基因和GC基因型为主，占比分别为56.8%和47.0%；+3027C/A位点以C等位基因和CC基因型为主，占比分别为82.7%和68.4%；相似地，+3035C/T位点以C等位基因和CC基因型为主，占比分别为82.1%和67.3%；+3142C/G位点以C等位基因和CG基因型为主，占比分别为59.2%和51.8%；+3187A/G位点以G等位基因和AG基因型为主，占比分别为56.0%和47.6%；+3196C/G位点以C等位基因和CC基因型为主，占比分别为99.7%和99.4%，未发现GG基因型。

表2 HLA-G 3′UTR基因多态性位点等位基因和基因型分布(n=168)

2.3 HLA-G 3′UTR基因多态性位点连锁不平衡及单倍型分析

8个多态性位点的连锁不平衡分析应用SHEsis软件，用连锁不平衡系数D′进行检验分析，D′>0.7认为是强连锁，结果见图1(数值表示百分数，越接近1.0表示两个位点连锁越紧密，颜色越深表示两个位点连锁越紧密)。结果显示，除+3003C/T与14 bp ins/del、+3027C/A、+3035C/T外，其他D′值均大于0.7，认为这8个位点紧密连锁，可以构建单倍型。

图1 HLA-G 3′UTR 8个基因多态性位点间的连锁不平衡分析情况

SHEsis结果显示，8个基因多态性位点可以构建14个单倍型，对常见的频率较高的7个单倍型进行统计，分别是UTR-1(DTG CCC GC)、UTR-2(ITC CCG AG)、UTR-3(DTC CCG AC)、UTR-4(DCG CCC AC)、UTR-5(ITC CTG AC)、UTR-6(DTG CCC AC)、UTR-7(ITC ATG AC)，单倍型组成从左到右为14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G，见表3。UTR-1，UTR-3，UTR-7频率大于0.03，三者共占94.3%(317/336)，分别占55.0%、23.8%、15.5%，其中UTR-1超过半数以上。

表3 HLA-G 3′UTR多态性位点单倍型分析

3 讨 论

HLA-G基因位于人染色体6p23.1，全长6.0 kb，由8个外显子和7个内含子组成，从部分6号外显子开始延伸至多聚A尾巴前端，包括7号外显子、8号外显子的区域被称为3′UTR[6]。HLA-G 3′UTR基因多态性调控了HLA-G的表达水平，与多种临床疾病有关，从对妊娠期HLA-G的研究开始，该领域就关注了HLA-G在恶性和炎症性疾病中的表达及其可能的重要性，以及在心脏和肝/肾器官移植中的应用。HLA-G选择性高表达于绒毛外滋养细胞，促进母胎界面免疫耐受状态的维持[7]。HLA-G 3′UTR参与稳定转录本，影响mRNA的翻译水平和分子表达，改变疾病的遗传易感性[8-10]。有研究报道，HLA-G与复发性流产、先兆子痫等病理妊娠有较大相关性[11-12]，但多项研究结果具有一定争议性，这可能是由于基因多态性与种族、地区、环境有关。因此，调查本地区的HLA-G 3′UTR位点基因多态性分布特点，分析基因多态性位点之间的连锁不平衡和单倍型具有一定必要性。

本研究通过检测分析温州地区汉族健康妊娠妇女HLA-G 3′UTR 8个基因多态性位点：14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G，发现8个基因多态性位点具有各自的分布特征，以纯合子基因型为主的位点如14 bp ins/del、+3027C/A、+3035C/T，以杂合子基因型为主的位点如+3010G/C、+3142C/G、+3187A/G；而+3003C/T、+3196C/G未检测到CC和GG基因型。SNPs在人类基因组中广泛存在，占所有已知基因多态性的90%以上，具有稳定遗传的特点。某些SNPs虽然与疾病无关，但是因为与致病基因相邻或者多个SNPs的联合效应对疾病产生重要影响。近年来，越来越多的研究关注了联合检测SNPs构建单倍型对疾病的影响。本研究连锁不平衡分析发现，8个基因多态性位点紧密连锁，在对常见的8个单倍型统计分析发现温州地区妊娠妇女单倍型的分布特征，UTR-1、UTR-3、UTR-7单倍型频率大于0.03，三者共占94.3%，其中UTR-1超过半数以上，是温州地区妊娠妇女主要的单倍型。

LUCENA-SILVA等[13]研究了巴西南部和北部健康人群HLA-G 3′UTR分布，发现在+3003CT、TT基因型的分布有明显差异，说明同种族不同区域基因多态性位点的分布存在差异；与本研究相比，在多个位点具有差异，巴西人群14 bp位点以杂合子del/ins为主，本研究结果以纯合子del/del为主；巴西人群以+3142G等位基因为主，而本研究以+3142C等位基因为主；巴西人群以+3187A等位基因、AA纯合子基因型为主，而本研究以+3187G等位基因、AG杂合子基因型为主。新西兰健康育龄妇女HLA-G 3′UTR基因多态性位点的分布[14]与本研究相似，但在新西兰健康育龄妇女中未发现+3027AA基因型。研究报道，14 bp ins/del位点基因多态性影响HLA-G mRNA的稳定性，可能与miRNA结合位点的破坏有关[2]。+3027C/A、+3142C/G、+3187A/G等SNP位点也都是miRNA的结合位点，或与AU富集区有关，位点的多态性影响miRNA的稳定性和降解速度，以此在转录后调节HLA-G的表达[9]。单倍型分布特点上，巴西人群UTR-1、UTR-2、UTR-3占多数[13]，分别为29.5%、22.8%、15.8%，与本研究结果不同；新西兰健康育龄妇女的单倍型以UTR-1、UTR-2、UTR-4为主[14]，分别为33.3%、26.0%、19.8%，虽然等位基因和基因型与本研究结果相似，但是单倍型却不同。已有报道显示，HLA-G 3′UTR单倍型与先兆子痫[15]、复发性流产[16]、败血症[17]等有一定关联性。HLA-G 3′UTR单倍型与HLA-G的表达有关，UTR-1与高水平表达相关，UTR-5、UTR-7与低水平表达相关[18]，UTR-2/3/4/6与中等水平表达相关。各种族各地区不同人群在基因多态性及单倍型的分布差异可能是疾病分布不同的原因，育龄妇女与其他人群具有不同的HLA-G 3′UTR基因多态性和单倍型分布，不同地区育龄妇女的分布也不尽相同。以健康妊娠妇女为代表调查本地区健康育龄妇女的HLA-G 3′UTR基因多态性分布，可以更好地为妊娠期并发症的研究打下基础，深入了解HLA-G 3′UTR在妊娠中的作用。

综上所述，本研究中温州地区汉族健康妊娠妇女HLA-G 3′UTR基因多态性位点的基因型和等位基因、单倍型的分布特征明显，等位基因以14 bp del、+3003T、+3010G、+3027C、+3035C、+3142C、+3187G、+3196C为主，基因型以14 bp del/del、+3003TT、+3010GC、+3027CC、+3035CC、+3142CG、+3187AG、+3196CC为主，单倍型以UTR-1(DTG CCC GC)、UTR-3(DTC CCG AC)、UTR-7(ITC ATG AC)为主，UTR-1是最主要的单倍型。后续将进一步深入研究HLA-G 3′UTR基因多态性及单倍型在妊娠并发症如先兆子痫、复发性流产等的意义，以及与mRNA和miRNA相关的分子机制。