富血小板血浆对大鼠宫颈糜烂的治疗作用及其对炎性因子表达的影响*

张 兰，温路生，陈 婧，张小燕，陈燕萍，吴明燕，李佳怡，陈艳惠，陈 慧△

(厦门大学附属东南医院：1.妇产科；2.病理科，福建漳州 363000)

宫颈炎是妇科常见疾病，在已婚女性中发病率高[1]。子宫颈主要由结缔组织构成，宫颈管黏膜为单层柱状上皮，抗感染能力较差，易发生感染；子宫颈阴道部由复层鳞状上皮覆盖，与阴道鳞状上皮相延续，阴道为有菌的环境，阴道炎症均可引起子宫颈阴道部的炎症[2]。由于阴道炎症刺激、物理化学因素刺激及机械性刺激等均可造成子宫颈不同程度的损伤，引发宫颈炎。长期的宫颈炎或伴随人乳头瘤病毒(HPV)感染可导致宫颈内瘤样变，进而演化为宫颈癌[3]。因此，宫颈炎的治疗十分重要。研究表明，血小板含有大量的生长因子和细胞因子，对炎症、软组织愈合产生影响。此外，血小板也释放许多具有生物活性的蛋白，可以吸引巨噬细胞、间充质干细胞等，不仅促进清除退化、坏死组织，还可以提高组织再生和愈合能力[4]。富血小板血浆(PRP)是血小板浓度为全血浓度2～7倍的血浆，含有丰富的血小板[5]。而血小板内含有许多在软组织愈合中起决定作用的生长因子与细胞因子，可以保持身体的微环境，在不打破身体微环境平衡的情况下提供丰富的促进愈合的因子。自体PRP具有制作简单、价格低廉、易获得、损伤小等特点[6]；并且，由于自体PRP消除了免疫反应，无传播疾病的风险，在临床中得到越来越广泛的应用。本研究通过构建大鼠宫颈炎修复模型，探讨PRP在宫颈炎修复方面的作用，为临床应用提供立论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

60只SD大鼠(雌性，未孕)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重(220±20)g。实验动物设计方案严格经过本院伦理委员会审查。将实验大鼠饲养于动物房，温度(23±2)℃，湿度50%～60%，光照/黑暗周期为12 h。2周适应环境，正常饮水、进食。

1.1.2主要试剂

苯酚购自天津市登丰化学品有限公司。大鼠白细胞介素(IL)-1β试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒和大鼠IL-6试剂盒均购自南京凯基生物科技有限公司。苏木素-伊红(HE)试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自美国Abcam公司。兔抗IL-1β抗体、兔抗TNF-α抗体、兔抗IL-6抗体和山羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠宫颈糜烂模型制备

参照文献[7]造模：苯酚加蒸馏水、阿拉伯树胶制成25%胶浆。大鼠造模时，抽取0.15 mL该胶浆进行阴道深部注射，每3天注射1次，共4次。造模期间大鼠喂正常饲料，给予自由饮水。

1.2.2分组及给药

SD大鼠分为4组：对照组、假手术组、模型组和PRP组，每组15只。模型组和PRP组大鼠按1.2.1进行宫颈糜烂模型制作；假手术组则在同一时间注射等体积的无菌生理盐水；对照组大鼠不做任何处理。于造模后2 d经阴道注射相应剂量的生理盐水或PRP溶液，每天给药1次，连续12 d。对照组：无菌生理盐水0.15 mL；假手术组：无菌生理盐水0.15 mL；模型组：无菌生理盐0.15 mL；PRP组：PRP溶液0.15 mL。参照文献[8]方法制备PRP：用真空抗凝采血管采集6 mL静脉血，上下颠倒数次混匀，另采集6 mL静脉血测定原始血小板浓度作为对照；采用二次离心法制备PRP，先将装有6 mL静脉血的A离心管离心10 min，离心后血液分为3层，吸取上部血浆及界面下2 mm的红细胞转移致B离心管中，B离心管再次离心15 min，去掉上部含有极少量未沉降血小板的血浆层，剩余血浆及血细胞成分摇匀即PRP制备完成。

1.2.3取材

实验结束后，大鼠经腹腔注射10%水合氯醛溶液进行麻醉。打开大鼠腹腔，于心尖处取血，并置于1.5 mL EP管中，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清进行后续的ELISA。接着取子宫和子宫颈，由同一实验人员精确剪取子宫角到子宫颈位置的组织，滤纸吸干血迹，称重。组织用4%多聚甲醛固定，进行HE染色；另取子宫颈组织放入-80 ℃保存，后续进行Western blot实验。

1.2.4HE染色

取各组大鼠子宫颈组织，经固定、常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制成5 μm的石蜡切片。切片放入苏木素染液中5 min，自来水清洗后，置于1%盐酸乙醇分化数秒，并用流水冲洗；切片放入伊红染液中染色 3 min，流水稍洗；之后切片置于梯度乙醇(70%、80%、90%、100%)中脱水，各5 min，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，分别5 min。将切片取出，用滤纸轻轻拭干切片上残余的二甲苯，在组织上滴加中性树胶封片，使用莱卡显微镜进行拍摄。

1.2.5ELISA

按1.2.3分离出的各组大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶联仪在450 nm波长处依序测定各孔的吸光度值(A450值)，根据A450值所绘制的标准曲线查出血清IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平。

1.2.6Western blot

取各组大鼠宫颈组织100 mg，加入1 mL制备好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法测定总蛋白含量。用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶分离蛋白并转移到PVDF膜上。用含有5%脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液(PBS)封闭膜1 h，然后加入稀释后的IL-1β、TNF-α、IL-6和β-actin一抗，4 ℃摇床上孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入对应于一抗种属来源的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，在室温摇床上孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。使用电化学发光(ECL)法化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带进行灰度值分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 PRP对宫颈糜烂大鼠行为学的影响

实验期间，对照组和假手术组大鼠精神良好，饮食正常，阴道口光滑，未见分泌物，且阴道口未见红肿；模型组大鼠精神状态萎靡，表现为发抖、少动、竖毛，食欲显著下降，阴道出现黄色黏稠分泌物，宫颈口红肿严重；与模型组比较，PRP组大鼠的症状明显得到改善，精神状态好转，食欲有所增加，阴道分泌物减少，红肿程度也减轻。在实验期间，模型组有2只大鼠死亡，PRP组有1只大鼠死亡。

2.2 PRP对宫颈糜烂大鼠宫颈质量和宫颈脏器指数的影响

与对照组和假手术组相比，模型组大鼠宫颈质量和宫颈脏器指数明显增加(P<0.01)；与模型组相比，PRP组大鼠宫颈质量和宫颈脏器指数明显下降(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠宫颈质量和宫颈脏器指数比较

2.3 PRP对宫颈糜烂大鼠宫颈组织病理变化的影响

HE染色结果表明，对照组和假手术组大鼠宫颈组织未见病理性变化；模型组大鼠宫颈组织出现上皮细胞糜烂、变性、坏死，炎性细胞浸润；PRP组大鼠宫颈组织病理变化较模型组减轻，上皮细胞糜烂现象得到改善，见图1。

a：炎性细胞浸润；b：上皮细胞浸润；c：坏死；d：鳞状上皮细胞浸润；e：上皮糜烂。

2.4 PRP对宫颈糜烂大鼠血清IL-1β、TNF-α及IL-6水平的影响

与对照组和假手术组相比，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平明显上升(P<0.01)；与模型组相比，PRP组大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平明显下降(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α及IL-6水平比较

2.5 PRP对宫颈糜烂大鼠宫颈组织IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平的影响

与对照组和假手术组相比，模型组大鼠宫颈组织中IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平明显上调(P<0.01)；与模型组相比，PRP组大鼠宫颈组织中IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平明显下调(P<0.05)，见图2、表3。

图2 各组大鼠宫颈组织中IL-1β、TNF-α及IL-6的表达

表3 各组大鼠宫颈组织中IL-1β、TNF-α及IL-6表达水平比较

3 讨 论

宫颈炎主要由沙眼衣原体和淋病奈瑟菌感染引起，阴道毛滴虫和HPV感染也与宫颈炎的发病有关[9]。患有宫颈炎症和HPV感染的妇女罹患高度鳞状上皮内病变及宫颈癌的风险增加[10-11]。此外，慢性炎症被认为是包括宫颈癌在内的各种癌症发展的促成因素。目前，临床上常采用局部药物治疗或局部物理治疗(如激光、冷冻、微波、电熨等)。通过治疗使宫颈创面鳞状上皮化生，达到重现光滑宫颈的目的。但药物治疗疗程长，效果不确切，花费高；而物理治疗后阴道分泌物增多，甚至出现大量排液，术后1～2周脱痂时出血，创面愈合时间长，治疗后在一定的机械刺激或炎症刺激下易再复发。此外，物理治疗疗效与医师的操作水平、治疗的深浅度密切相关，并且可引发术后出血、宫颈狭窄、不孕及感染。目前针对宫颈炎临床上尚无明确的一线治疗方案。

研究发现，IL-1β和TNF-α是具有免疫功能的调节因子，参与多种疾病的发生、发展[12]。在宫颈炎中TNF-α可促进炎性细胞的黏附和浸润，引起组织损伤。在宫颈炎中炎性因子表达上调，如IL-1β和TNF-α表达水平显著升高。IL-1β和TNF-α的生物学功能重叠，在许多疾病中其表达呈正相关，外周血 TNF-α、IL-1β及IL-6等炎性因子水平明显升高，机体损伤进一步加重[13]。本研究发现，宫颈糜烂大鼠IL-1β、TNF-α和IL-6水平较健康大鼠升高，说明IL-1β、TNF-α和IL-6的过度表达是引发宫颈糜烂的重要病理环节之一，是宫颈炎发生、发展的病理学基础。

PRP是由全血样品制备的含有许多生长因子的血浆。PRP已用于治疗多种疾病，包括糖尿病足溃疡[14]、克罗恩病[15]等。体外研究表明，PRP可以增强多种类型细胞的增殖[16]。本研究发现，PRP能减轻炎性反应，对宫颈炎有一定的治疗作用。

综上所述，PRP对宫颈糜烂有一定治疗作用，其机制可能与通过抑制IL-1β、TNF-α和IL-6的表达而减轻炎性反应有关。