七氟烷通过诱导SIRT1依赖型自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

冉 艳，卢明珊，曾德亮，张笃文，金宏玲

缺血性脑卒中是一种中老年人常见的疾病，是由于流向脑组织的动脉血管阻塞引起的。当血栓溶解治疗成功后，血流供应恢复会造成更加严重的二次损伤，这一过程被称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。CIRI的病理机制十分复杂，涉及了包括炎症反应、氧化应激、能量代谢损伤、钙超载、凋亡以及自噬等一系列因素，其中自噬起着较为关键的作用。七氟烷是一种新型吸入式麻醉药，具有起效迅速，组织摄取量少，苏醒较快等优点。研究表明七氟烷还具有颅神经保护的作用，可减轻由CIRI引起的损伤。目前对七氟烷在CIRI中的保护作用的机制研究尚存在许多空缺。该研究通过建立大鼠脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，并通过七氟烷处理模型，探究七氟烷对CIRI损伤的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

七氟烷（批号：20080681）购自山东鲁南贝特制药有限公司；戊巴比妥钠（批号：P010）购自美国 Sigma-Aldrich；2%TTC染色液（批号：G3005）、HE染色液（批号：G1120）、RIPA裂解液（批号：R0010）、TRIzol提取液（批号：15596026）购自北京索莱宝生物公司；TUNEL凋亡试剂盒（批号：C1091）购自上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批号：H052）、白细胞介素（interleukin，IL）-6（批号：H007）、IL-10（批号：H009）ELISA试剂盒购自南京建成生物有限公司；SsoFastEva-GreenSupermix试剂盒（批号：1725200）购自美国 Bio-rad公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA，批号：S2767）购自美国 Selleck公司；沉默信号调控因子1（silent information regulator 1，SIRT1）siRNA购自上海吉玛生物技术公司；引物由上海生工生物公司合成；β-actin、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3，批号：ab51520）、p62（批号：ab109012）、SIRT1（批号：ab12193）抗体购自英国Abcam公司。

1.2 实验动物

100只雄性8周龄SPF级SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，体质量300～320 g，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，在常温、标准湿度的封闭条件下，12 h／12 h昼夜交替喂养3 d，水和食料正常供给。实验由贵州省人民医院实验动物伦理委员会审查批准（LLPZ-003），实验动物使用遵循3R原则。

1.3 分组及处理方法

50只大鼠随机分为假手术组、MCAO模型组、七氟烷处理组（0.6%、1.2%、2.4%），每组10只，腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg／kg进行麻醉，通过加热毯维持体温。假手术组仅暴露出左颈内动脉，不进行其他处理；MCAO模型组预先置于麻醉室中每天通过98% O处理60 min，连续4 d。预处理结束24 h后，暴露左颈内动脉后，单丝尼龙缝合线制作线栓经颈内动脉进入大脑前动脉，制作MCAO模型，缺血90 min后取出线栓进行再灌注，再灌注24 h后先行神经功能损伤评分，之后处死大鼠用于后续实验。七氟烷处理组（0.6%、1.2%、2.4%）大鼠预先置于麻醉室中每天通过对应体积分数的七氟烷＋98% O处理60 min，连续4 d。之后按与MCAO模型组相同的方法进行建模。余下50只大鼠随机分为假手术组、MCAO模型组、七氟烷处理组（1.2%）、七氟烷＋3-MA组、七氟烷＋siRNA组，每组10只。其中假手术组、MCAO模型组、七氟烷处理组（1.2%）按照与之前同样的方法建模。七氟烷＋3-MA组和七氟烷＋siRNA组大鼠固定于立体定位仪上，七氟烷＋3-MA组于左侧脑室30 min内注射 10μg／μl 3-MA 600 nmol，七氟烷＋siRNA组于左侧脑室以1μl／min的速度注射2 μg／μl的 SIRT1 siRNA稀释液 15μl，注射结束后，将针头固定10 min，然后缓慢抽出。在注射完成24 h后，按照七氟烷处理组（1.2%）的方法进行建模。

1.4 神经功能评分

再灌注24 h后，对大鼠进行神经功能损伤评估，评分标准如下：0分，无神经功能缺陷表现；1分，对侧前肢无法完全伸展；2分，运动时向对侧方向大圈；3分，运动时向对侧倾倒；4分，无自主行动并且意识昏迷；5分，死亡。

1.5 脑梗死体积分数检测

腹腔注射3%戊巴比妥钠50mg／kg进行麻醉，迅速取出全脑，在-20℃条件下冷冻15 min。将冷冻的大脑迅速切成2 mm薄片，使用2% TTC染液室温避光染色20min，4℃的4%多聚甲醛固定48 h，使用Image J图像分析软件进行梗死面积分析，脑梗死体积分数计算方法为：脑梗死体积分数＝[总梗死体积-（完整同侧半球体积-完整对侧半球体积）]／对侧大脑半球体积×100%。

1.6 脑含水量检测

再灌注24 h后，迅速取出大脑并立刻称取大脑湿重，随后将大脑置于烘箱之中120℃烘干24 h，确保其质量不再发生变化，称重记为大脑干重，脑含水量计算公式为：脑含水量（%）＝（湿重-干重）／湿重×100%。

1．7 HE染色检测脑组织病理变化

使用4%多聚甲醛固定脑组织24 h，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，使用HE染色液进行染色，光学显微镜观察染色结果。

1．8 TUNEL染色检测细胞凋亡

使用4%多聚甲醛固定脑组织24 h，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，按TUNEL细胞凋亡试剂盒的方法进行染色，光学显微镜下观察实验结果，凋亡率以凋亡细胞／100个细胞表示。

1．9 ELISA法检测炎症细胞因子含量

将脑组织使用预冷的0.9%氯化纳溶液进行匀浆处理，以ELISA试剂盒提供的方法检测TNF-α、IL-6、IL-10含量。

1．10 RT-PCR法检测SIRT1基因表达

将脑组织匀浆处理后，TRIzol提取组织中的RNA，反转录合成cDNA，根据SsoFastEva-GreenSupermix试剂盒说明提供的方法进行PCR反应，反应条件设置为：0℃、2 min，95℃、15 s，60℃、1 min，循环数设为40次，通过2法处理实验结果。

1．11 Westernblot检测蛋白表达

将脑组织匀浆处理后，RIPA试剂提取总蛋白，BCA试剂盒定量，10%SDS-PAGE电泳分离各组蛋白，每孔上样量30 μg，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液进行漂洗，二抗室温孵育2 h，ECL显色液显色，通过凝胶成像系统分析蛋白表达。

2 结果

2．1 七氟烷对大鼠CIRI损伤的影响

与假手术组比较，MCAO模型组大鼠脑梗死体积分数、脑含水量升高（P＜0.01）；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（0.6%）脑梗死体积分数降低（P＜0.05），七氟烷处理组（1.2%、2.4%）大鼠脑梗死体积分数、脑含水量均降低（P＜0.01）。同时，假手术组大鼠大脑皮质神经细胞结构完整，排列整齐致密，MCAO模型组神经细胞发生萎缩以及坏死，细胞分布不均匀，七氟烷处理组（0.6%、1.2%、2.4%）神经细胞状况得到改善。与假手术组比较，MCAO模型组脑组织中细胞凋亡百分率升高（P＜0.01）；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（0.6%、1.2%、2.4%）细胞凋亡百分率降低（P＜0.05，P＜0.01）。此外，与假手术组比较，MCAO模型组神经功能评分高于假手术组（P＜0.01）；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（1.2%、2.4%）神经功能评分低于MCAO模型组（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 七氟烷对大鼠CIRI的影响（±s，n＝10）

图1 七氟烷对大鼠CIRI的影响（n＝10）

2．2 七氟烷对大鼠CIRI的炎症反应的影响

与假手术组比较，MCAO模型组大鼠脑组织中TNF-α、IL-6含量水平升高（P＜0.01），差异有统计学意义；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（0.6%）、七氟烷处理组（1.2%）、七氟烷处理组（2.4%）脑组织中TNF-α、IL-6含量水平降低（P＜0.05，P＜0.01），差异有统计学意义。同时，与假手术组比较，MCAO模型组大鼠脑组织中IL-10含量水平降低（P＜0.01），差异有统计学意义；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（0.6%）、七氟烷处理组（1.2%）、七氟烷处理组（2.4%）脑组织中IL-10含量水平升高（P＜0.05，P＜0.01），差异有统计学意义。见表2。

表2 七氟烷对大鼠CIRI炎症反应的影响（±s，n＝10）

2．3 七氟烷对CIRI大鼠SIRT1的表达以及自噬的影响

如图2A所示，与假手术组比较，MCAO模型组大鼠脑组织中SIRT1基因表达水平升高（P＜0.01）；与 MCAO模型组比较，七氟烷处理组（1.2%、2.4%）大鼠脑组织中SIRT1基因表达水平升高（P＜0.01）。同时，如图2B、2C所示，与假手术组比较，MCAO模型组大鼠脑组织中SIRT1、p62蛋白，LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率升高（P＜0.01）；与 MCAO模型组比较，七氟烷处理组（0.6%）大鼠脑组织中SIRT1蛋白表达升高，LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率升高（P＜0.05），七氟烷处理组（1.2%、2.4%）大鼠脑组织中SIRT1蛋白表达升高，LC3Ⅱ、LC3Ⅰ比率升高，p62蛋白表达降低（P＜0.01）。

图2 七氟烷对SIRT1表达以及自噬的调控作用（n＝10）

2．4 SIRT1沉默及自噬对七氟烷处理后CIRI大鼠脑组织的保护作用的影响

如表3所示，与假手术组比较，MCAO模型组脑梗死体积分数、脑含水量升高（P＜0.01）；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（1.2%）脑梗死体积分数、脑含水量降低（P＜0.01）；与七氟烷处理组（1.2%）比较，七氟烷 ＋3-MA组和七氟烷＋siRNA组脑梗死体积分数、脑含水量升高（P＜0.05，P＜0.01）。同时，如图3所示，假手术组大脑皮质组织无病理变化，MCAO模型组大脑皮质组织排布紊乱，并发生细胞萎缩以及坏死，七氟烷处理组（1.2%）病理变化减轻，3-MA或siRNA加入减弱了七氟烷对大脑皮质组织的保护作用。与假手术组比较，MCAO模型组脑组织细胞凋亡百分率升高（P＜0.01）；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（1.2%）细胞凋亡百分率降低（P＜0.01）；与七氟烷处理组（1.2%）比较，七氟烷＋3-MA组和七氟烷＋siRNA组细胞凋亡百分率升高（P＜0.01）。

表3 SIRT1沉默及自噬抑制对大鼠CIRI的影响（±s，n＝10）

图3 HE及TUNEL染色观察SIRT1沉默及自噬抑制对CIRI病理变化和细胞凋亡的影响 ×400

2．5 SIRT1沉默及自噬对七氟烷处理后CIRI大鼠炎症反应的抑制作用的影响

如表4所示，与假手术组比较，MCAO模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-6含量升高（P＜0.01）；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（1.2%）脑组织中TNF-α、IL-6含量降低（P＜0.01）；与七氟烷处理组（1.2%）比较，七氟烷 ＋3-MA组、七氟烷＋siRNA组脑组织中TNF-α、IL-6含量升高（P＜0.05，P＜0.01）。同时，与假手术组比较，MCAO模型组中 IL-10含量降低（P＜0.01）；与MCAO模型组比较，七氟烷处理组（1.2%）中IL-10含量升高（P＜0.01）；与七氟烷处理组（1.2%）比较，七氟烷＋3-MA组、七氟烷＋siRNA组中 IL-10含量降低（P＜0.01）。

表4 SIRT1沉默及自噬抑制对CIRI炎症反应的影响（n＝10）

2．6 SIRT1沉默对自噬的调控作用

如图4所示，与假手术组比较，MCAO模型组大鼠脑组织中SIRT1、p62蛋白水平、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率升高（P＜0.01）；与 MCAO模型组比较，七氟烷处理组（1.2%）SIRT1蛋白水平、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率升高，p62蛋白水平降低（P＜0.01）；与七氟烷处理组（1.2%）比较，七氟烷＋3-MA组LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率降低，p62蛋白水平升高（P＜0.01），七氟烷＋siRNA组LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率、SIRT1蛋白水平降低，p62蛋白水平升高（P＜0.01）。

图4 Western blot检测SIRT1沉默对自噬标记蛋白LC3、p62表达的影响（n＝10）

3 讨论

自噬是一种进化上高度保守的保护机制，可通过溶酶体系统调控细胞内细胞器和蛋白的质量或数量，以维持细胞的生存。近期的研究表明，自噬在CIRI中具有关键的作用，在缺血条件下，自噬通过降解蛋白质，提供了维持细胞活动所需的能量，同时降解掉未正确折叠或损伤的蛋白质，为新蛋白的合成提供原料。七氟烷在心肌缺血再灌注中可通过调控自噬发挥心肌保护作用，推测在CIRI中可能存在着类似的作用机制。本研究首先建立了MCAO模型大鼠，检测了脑梗死体积、脑水肿、组织病理变化等指标，结果显示，在CIRI模型大鼠中，脑梗死体积分数、脑部含水量均升高，而大脑皮质也出现了病理性改变以及细胞凋亡，通过七氟烷进行预处理可减轻上述各指标的变化。同时，通过神经功能评分对大鼠CIRI后神经功能损伤进行了评估，表明MCAO模型大鼠的神经功能受损，七氟烷预处理可减轻MCAO模型大鼠的神经功能损伤状况。此外，MCAO模型大鼠脑组织中 TNF-α、IL-6含量升高，IL-10含量降低，七氟烷可扭转这些细胞炎症因子的改变，从而减轻CIRI的炎症反应。上述结果表明，七氟烷可减轻CIRI造成的损伤及炎症反应。

SIRT1是去乙酰化酶家族的成员之一，SIRT1可对下游众多靶蛋白起去乙酰化的催化作用，这些蛋白是细胞周期、昼夜节律、线粒体功能、新陈代谢等众多通路中的重要成员。研究表明SIRT1与自噬有着重要联系，有研究报道了白藜芦醇可通过SIRT1依赖性自噬抑制NLRP3炎症小体，从而减轻大鼠CIRI损伤，同样有文献报道七氟烷在心肌缺血再灌注中可上调SIRT1表达起心肌保护作用，推测七氟烷在CIRI中的作用可能与SIRT1有关。该研究显示MCAO模型大鼠脑组织中SIRT1表达升高，同时LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率、p62蛋白水平升高，七氟烷处理可进一步提高SIRT1表达水平，同时进一步提高LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率，降低p62蛋白水平。LC3和p62是自噬的标志物，其中LC3Ⅰ可在自噬发生时与自噬体表面的磷脂酰乙醇胺作用形成LC3Ⅱ，表现为LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率升高；p62可通过与泛素化蛋白结合并最终在自噬溶酶体内降解，在自噬流通畅时表现为p62水平降低。进一步通过自噬抑制剂3-MA和SIRT1 siRNA处理显示，自噬的阻断和SIRT1的敲除均引起了脑梗死体积增加，脑水肿、病理变化加重，细胞凋亡水平提高，炎症反应水平升高，同时SIRT1的敲除可引起LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比率降低，p62蛋白水平升高。上述结果表明CIRI可引起应激反应，启动自噬程序维持细胞存活，七氟烷处理可加强自噬反应，减轻CIRI损伤，这一过程的机制与SIRT1的激活有关。

综上所述，七氟烷可通过激活SIRT1表达，加强自噬反应，进而降低CIRI的病理变化、细胞凋亡以及炎症反应。该研究探讨了七氟烷对CIRI损伤的作用机制，为CIRI的治疗提供了新的参考。