Cyp4a14基因对小鼠肠炎模型肠道黏膜氧化应激反应的影响

肖中岳，轩青霞，高 强

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一类目前临床上尚无法治愈的慢性肠道病变。炎症因子引起的机体过氧化反应是IBD发病时引起肠道损伤的重要因素。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱发细胞核因子 κB（NF-κB）表达，而NF-κB可进一步诱发炎症因子如白细胞介素 1-β（interleukin-1β，IL-1β）和 TNF-α的表达，加强机体炎症反应。丙二醛（malondialdehyde，MDA）作为氧化应激的重要标志物，可以有效地反映组织氧化应激反应的程度。Cyp4a14基因可调节宿主细菌感染引起的结肠组织炎性反应，但其发生机制尚不清楚。该研究使用葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）建立 Cyp4a14野生型 （Cyp4a14） 和基因敲除纯合型（Cyp4a14）小鼠肠炎模型，探讨 Cyp4a14基因与MDA及相关炎症因子对小鼠肠道黏膜氧化应激反应的影响，为进一步研究Cyp4a14基因对IBD发病的调节作用和新型药物研发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 所选健康清洁级129S1／SvJ种系 Cyp4a14和 Cyp4a14小鼠（河南科技大学第一附属医院动物实验中心饲养），保持小鼠生活环境清洁卫生及通风良好，给予足量SPF级混合配方颗粒饲料（购于北京华阜康生物公司）和新鲜饮水，自由饮食。入组标准：雄性，6～8周龄，体质量20～23 g。

1.1.2 主要材料 DSS试剂购于美国MP Biomedicals公司；MDA试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所；RNA提取试剂购于美国Invitrogen公司；逆转录和PCR试剂盒购于日本Takara公司；引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 入组前基因鉴定 选用 Cyp4a14和Cyp4a14小鼠作为种鼠，子代可出现3种表型：野生型 Cyp4a14、杂合子 Cyp4a14和基因敲除纯合型Cyp4a14。剪取小鼠尾巴尖端约0.5 cm，抽提尾尖DNA，采用PCR扩增，最后用琼脂糖凝胶电泳鉴定基因。引物序列：Cyp4a14，5′-TCAgggTT-gAAAAAgAATgAC-3′；Cyp4a14，5′-TgCCCATTTT TCACACAAAA-3′；Cyp4a14，5′-gCCAgAggCCAC TTgTgTAg-3′。Cyp4a14和 Cyp4a14目的片段长分别为 299、199 bp，Cyp4a14目的片段长为299、199 bp，根据条带判断每只小鼠的基因型（图1），选择 Cyp4a14和 Cyp4a14小鼠入组实验。

图1 小鼠基因鉴定

1.2.2 入组与取材 将小鼠以个体为单位用掷硬币的方法（正面代表实验组、反面代表对照组）随机分配到对照组和实验组（DSS组）：Cyp4a14小鼠分 为 Cyp4a14对 照 组、Cyp4a14DSS组，Cyp4a14小 鼠 分 为 Cyp4a14对 照 组 和Cyp4a14DSS组，每组10只，共40只。所有入组小鼠适应性喂养1周后，对照组给予饮用水，DSS组给予3.0%DSS饮用水，均自由饮用6 d。足量饲料喂养。期间定时观测小鼠体质量变化、进食饮水量、粪便情况及精神状态等。参照Jackson et al的方法进行疾病活动度（disease activity index，DAI）评分。于第6天造模结束乙醚麻醉后脱颈椎处死小鼠，打开胸腔，抽取小鼠心脏血，离心后取血清冻存备用。剖腹取出全段结肠，测量结肠长度，并参照张静等的方法进行结肠内出血评分。PBS漂洗后，自远端依次取0.5 cm、1.0 cm、1.0 cm长度结肠组织，分别用于：固定包埋切片，备HE染色等使用；放入RNA Later液中，供提取RNA使用；放入液氮罐中冻存待用。

1.2.3 组织病理学观察 HE染色后，高倍镜下每张切片随机选择10个视野，参照Esworthy et al实验方法行组织病理学评分。

1.2.4 炎症因子IL-1β和TNF-αmRNA表达水平提取结肠组织RNA，测量其纯度和含量。使用Takara试剂盒将RNA逆转录为cDNA。冰上制备PCR反应体系（表1），置于PCR仪进行扩增，设置扩增程序：95℃、30 s，95℃、5 s，59℃、30 s，95℃、15 s，循环40次。以β-actin基因为内参，每样本3个复孔，使用2法分析各指标 mRNA的相对表达倍数。

表1 引物序列

1.2.5 检测血清MDA浓度 将血清加入硫代巴比妥酸中，在较高温度环境中反应15 min，酶标仪测量535 nm处混合物的吸光度，测定血清中MDA浓度。

2 结果

2．1 基本情况及 DAI评分

Cyp4a14对照组和Cyp4a14对照组小鼠生长发育良好，皮毛光泽，活动、饮食、饮水未见异常。Cyp4a14DSS组小鼠于造模第4天出现进食、饮水量下降，精神低靡等，部分小鼠出现肛周潮湿、稀便等现象；数只小鼠于第6天出现稀血便，平均体质量下降近10%。Cyp4a14DSS组小鼠于造模第3天出现进食、饮水减少，并出现体毛凌乱、稀水便或血便等现象；第6天全组小鼠均出现血水便，平均体质量下降达20%，但无小鼠死亡。与两对照组相比，Cyp4a14DSS组和 Cyp4a14DSS组 DAI评分均增高，且Cyp4a14DSS组进一步增高（F＝1 242.298，P＜0.001）（图2）。

2.2 结肠长度及结肠内出血评分

造模结束后解剖小鼠，测量全段结肠长度，并对结肠内出血评分。Cyp4a14对照组和 Cyp4a14对照组小鼠结肠长度无差异，且均无结肠内出血；Cyp4a14DSS组小鼠结肠长度缩短，部分小鼠出现不同程度的结肠内出血；Cyp4a14DSS组的结肠长缩短更多，且结肠内出血现象也更加严重（表2）。

2.3 组织病理学评分

光镜下观察，Cyp4a14对照组和Cyp4a14对照组小鼠结肠黏膜结构完整，无炎细胞浸润现象；Cyp4a14DSS组小鼠结肠黏膜呈轻度炎症表现，结肠黏膜腺体大体完整，部分隐窝破坏及炎细胞局部浸润；Cyp4a14DSS组小鼠结肠黏膜呈重度炎症表现，黏膜变薄，上皮细胞大量缺失，黏膜及黏膜下细胞结构排列紊乱，炎细胞广泛浸润（图 3、4）。

图2 各组小鼠体质量变化及DAI评分

表2 各组小鼠结肠长度和结肠内出血评分（n＝10，±s）

2．4 结肠组织中IL-1β和TNF-αmRNA的表达

炎症因子 IL-1β和 TNF-αmRNA在 Cyp4a14对照组和Cyp4a14对照组小鼠结肠组织中表达均无差异，但随炎症程度增加，IL-1β和TNF-αmRNA在 Cyp4a14DSS组和 Cyp4a14DSS组小鼠结肠组织中表达不同程度升高（IL-1β：F＝1 057.379，P＜0.001；TNF-α：F＝40.819，P＜0.001）（图5）。

图3 小鼠结肠组织染色 HE染色 ×400

图4 小鼠组织病理学评分

图5 结肠组织中炎症因子m RNA相对表达倍数

2．5 血清MDA浓度

MDA浓度在Cyp4a14对照组小鼠血清中较Cyp4a14对照组下降，与两组对照组相比，Cyp4a14DSS组和 Cyp4a14DSS组小鼠血清 MDA浓度均升高，尤以 Cyp4a14DSS组升高更显著，四组小鼠之间均有差异（F＝573.233，P＜0.001）（图6）。

图6 各组小鼠血清中MDA含量

3 讨论

溃疡性结肠炎和克罗恩病是IBD最常见的两种类别，是一组影响消化系统的慢性炎症性疾病，IBD患者常出现反复发作的临床症状，如合并有黏液的血便或单纯血便、腹泻、腹痛等。部分严重的患者可能出现肠穿孔、肠道狭窄、梗阻等并发症需要住院甚至手术治疗。临床上目前对于IBD的主要治疗药物是咪唑硫嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤等免疫抑制剂及英利夫单抗等TNF-α抑制剂，但TNF-α是一种多效的免疫因子，长期使用这类药物可能造成心力衰竭甚至恶性肿瘤等严重并发症，因此研制新型治疗IBD的药物显得尤为重要。临床治疗的主要方法就是抑制免疫失调，减少肠道损伤，使肠道黏膜有时间自行修复并减少肠瘘或狭窄等并发症。

Cyp4a亚家族是细胞色素P450脂肪酸羟化酶，可以催化机体中长链脂肪酸和前列腺素ω-羟基化。不同于其他P450氧化酶，Cyp4a亚家族更容易诱导ω-1和ω-2碳基的第2个C-H结合点氧化，从而降解长链脂肪酸为二羟基酸，提供给细胞线粒体或过氧化物酶 β过氧化使用。研究表明Cyp4a14基因不仅在脂肪酸代谢方面起重要作用，而且参与了炎症反应在内的机体的多个生理过程，如Cyp4a14下调可以使机体的炎症反应变得温和并终止过度炎症反应对机体的损伤。本研究表明Cyp4a14DSS组小鼠实验期间出现活动异常、体质量骤降、严重血便等严重肠炎表现，Cyp4a14DSS组也出现稀血便、体质量下降等炎症表现，但较Cyp4a14DSS小鼠出现延迟且表现较轻。同样的DAI评分、结肠长度、结肠内出血评分和组织病理学结果也提示Cyp4a14基因缺乏的小鼠炎症较轻。进一步实验结果表明两DSS组小鼠结肠组织中IL-1β和TNF-αmRNA水平与对照组相比均升高，且 Cyp4a14DSS组升高程度较 Cyp4a14DSS组更甚。这与 Nyagode er al研究结果一致，以上提示Cyp4a14基因缺失使得小鼠对DSS诱导的肠道炎症反应敏感性下降，肠道黏膜损伤更轻。

MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，其本身也可以损伤肠黏膜组织，MDA浓度可以有效的反映组织发生氧化应激反应的程度。该研究表明两组DSS组小鼠血清中MDA浓度要远高于对照组，说明炎症发生时小鼠结肠组织出现过量的脂质过氧化反应，从而产生了大量的 MDA。Cyp4a14DSS组MDA增加较Cyp4a14DSS组更显著，且两组对照组血清中MDA的浓度也有差异，即Cyp4a14对照组较Cyp4a14对照组浓度下降。以上实验结果表明，Cyp4a14基因缺失会使小鼠体内MDA浓度下降，提示Cyp4a14基因可以促进机体的脂质过氧化反应。当小鼠受到病原体、化学物质等外界刺激时，Cyp4a14小鼠和 Cyp4a14小鼠体内脂肪过氧化反应均加剧，产生大量的 MDA，而Cyp4a14小鼠体内氧化应激的程度要高于Cyp4a14小鼠，推测Cyp4a14可能通过破坏体内氧化-抗氧化系统平衡，导致氧化产物和MDA产生，进而促进了机体的炎症反应。

综上所述，该研究表明Cyp4a14基因缺失使得小鼠体内发生脂质过氧化反应水平下降，对DSS引起的肠道炎症反应不敏感，提示Cyp4a14基因可能是小鼠结肠组织氧化应激的促进因素，并通过MDA参与炎性反应对肠道组织的损伤。