花生茎叶提取物异甘草素对C57小鼠睡眠和学习记忆能力的影响

李 磊，邓 磊，王烈成

睡眠是一种在哺乳动物、鸟类和鱼类等生物中普遍存在的自然休息状态。规律的睡眠是生存的前提，也是健康和生存的必须，但是根据调查显示，现代社会很多人都患有睡眠方面的障碍或者与睡眠相关的疾病，根据《2014中国睡眠指数》显示，目前我国有超过35%的居民面临严重的睡眠问题。这种现象不利于身体精力的恢复，长此以往会损害身体健康。所以关于缓解睡眠障碍的研究迫在眉睫，其中对于毒副作用更小的、具有改善睡眠作用的天然提取物的研究更有意义。

睡眠科学领域名中医王翘楚认为具有“昼开夜合”现象的豆科植物花叶中存在共同的改善睡眠的物质基础，花生茎叶也不例外。《滇南本草》《中药大辞典》《浙江药用植物志》和《福建药物志》中均有花生茎叶具有治疗失眠的功效的描述。现代中医学研究表明，花生茎叶中含有多种具有镇静作用的功能物质，但花生茎叶改善睡眠的功能因子尚不明确。探究花生茎叶促睡眠作用的功能因子和相关机制不仅使花生茎叶资源可以充分高效地利用，而且对天然提取物应用于临床治疗睡眠障碍等相关疾病具有深远的意义。现对异甘草素开展研究，为睡眠障碍的治疗提供一种新手段。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级10周龄雄性C57BL／6J小鼠，20～25 g，购自安徽医科大学实验动物中心。1%戊巴比妥钠（美国Sigma公司）；异甘草素标准品（中国农科院）；组织胶（日本 Toagosei公司）；造牙粉、义齿基托树脂（上海二医张江生物材料有限公司）。电子天平CP114（奥豪斯仪器有限公司）；小鼠适配器和高速颅骨钻（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；记录排线（东莞市耀博电子有限公司）；电极用银丝（美国Cooner Wire公司）；不锈钢小螺丝（M 1 cm×2 cm，哈利路亚精密金属制品有限公司）；MP150多导生理信号记录分析系统（美国Biopac公司）；Sleepsign睡眠分析软件（日本 Kissei Comtec株式会社）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物手术及其脑电记录实验 用4%戊巴比妥钠（0.04 ml／g）对小鼠行腹腔麻醉；待小鼠痛觉反射消失后，将其固定于小鼠适配器上；然后剪去小鼠头顶毛发并用75%乙醇消毒皮肤，沿正中线切开皮肤，分离皮下组织使颅骨充分暴露；分别于冠状缝前1.0 mm及人字缝前1.0 mm与颅骨中线右侧旁开1.5 mm处用颅骨钻钻通颅骨，用组织胶和牙科水泥将脑电电极固定于颅骨上，脑电电极下端触碰硬脑膜为度，用于记录大脑皮质脑电活动；再将两根肌电电极分别插入小鼠颈背部两侧的肌肉内，用于记录肌电活动。待小鼠恢复清醒后放入恒温、恒湿、隔音、静电屏蔽功能的节律箱内单独饲养，自由摄食和饮水，光照时间8：00 am—8：00 pm，温度22～24℃。手术后1周，将记录脑电和肌电的排线与小鼠头部的电极连接适应7 d，适应结束后采取24 h连续记录的方式。实验组每天灌胃给药异甘草素一次（剂量32.4 mg／kg，给药剂量是前期研究筛选的结果，此剂量根据异甘草素在花生茎秆提取液中的含量计算，模拟小鼠直接灌胃天然提取液的含量），对照组灌胃0.9%氯化钠溶液，连续给药7 d，在第7天灌胃后记录小鼠的脑电肌电。小鼠的睡眠-觉醒情况包括：觉醒（wake，W）、非快动眼睡眠（non-rapid eye movement，NREM）和快动眼睡眠（rapid eye movement，REM）。

1.2.2 水迷宫实验 先对小鼠进行训练，对照组8只（每天灌胃0.9%氯化钠溶液），实验组9只（每天灌胃异甘草素），将水迷宫分成四个象限，每只小鼠每天都从一个象限的中心放入，强迫小鼠游泳找到平台（第五象限），然后记录小鼠找到平台的时间。若小鼠在60 s内未找到平台，需要人为将小鼠引导至平台，并且让小鼠在平台待上10 s，连续训练1周，再进行实验。在实验当天，将第五象限撤走，小鼠只从第一象限放入，持续记录60 s，记录小鼠第1次找到第五象限的潜伏期和在第五象限停留的时间。

1.2.3 免疫组化c-fos染色 小鼠灌胃给药1 h后麻醉，用4%多聚甲醛灌流取脑组织，然后用4%多聚甲醛浸泡过夜固定，第2天先用20%的蔗糖溶液脱水，脑组织沉底表明脱水成功，再用30%的蔗糖溶液脱水至沉底，冷冻切片，脑片厚度为50 mm，进行免疫组化染色。

挑选出脑片，用 PBS洗3次，每次5 min；3% Triton X-100洗15 min；PBS洗5 min；5% BSA洗2 h（BSA为牛血清蛋白，用PBS配制而成）；孵育一抗过夜；脑片PBS洗3次，每次10 min；孵育二抗2 h；PBS洗3次，每次10 min；SABC孵育1 h；PBS洗3次，每次10 min；贴载玻片并晾干；DAB显色，每个脑片20 ml，显色5～20 min，晾干；脑片脱水，载玻片依次浸入70%乙醇5 min，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min，100%乙醇5 min，二甲苯5 min，二甲苯5 min，在二甲苯未干之前盖上盖玻片并晾干。然后使用正置荧光显微镜（10倍镜）观察小鼠脑片，在50倍镜下观察并拍摄，然后将图片拼成完整的脑片以便确认脑区，将对照组和给药组有差异的脑区在100倍镜下观察并比较。。

1.3 统计学处理

采用Sleepsign软件对脑电、肌电数据进行分析，使用GraphPad-prism-7.0软件对实验数据进行统计分析并作图，统计方法为t检验，实验结果以均数±标准误表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异甘草素对睡眠量的影响

通过脑电分析比较表明，在给药第7天，给药组小鼠进入睡眠的潜伏期短于对照组；给药组24 h睡眠总量高于对照组，其中NREM睡眠量高于对照组，但两组REM睡眠差异无统计学意义。见图1。

2.2 异甘草素对睡眠张力的影响

对小鼠24 h的NREM睡眠进一步统计分析，结果显示，在灌胃4 h之后，给药组小鼠的NREM睡眠量相对于对照组开始增加，并且睡眠量增长的趋势持续16 h左右，其中在给药12、14、16 h具有差异性（图2A）。将给药组和对照组小鼠在灌胃第7天NREM期间的脑电波能谱进行统计分析，结果显示给药组的脑电能谱高于对照组（图2B）。

2.3 异甘草素对小鼠的认知和记忆能力的影响

水迷宫实验结果显示，两组小鼠在第五象限被撤除后，找到第五象限的潜伏期和停留在第五象限时间差异均无统计学意义，由此可知，异甘草素不显著影响小鼠的记忆能力。见图3。

2．4 异甘草素对VLPO等脑区的作用

免疫组化实验结果显示，给药组 VLPO、VMPO、SFO脑区的c-fos表达量显著高于对照组，如图4B、4C所示。

3 讨论

本研究显示花生茎叶的提取物异甘草素具有促睡眠的药理作用，能够增加小鼠的NREM睡眠量，并且增加了NREM睡眠期间脑电的能谱；水迷宫实验显示对照组和给药组小鼠在找到第五象限的时间和在第五象限停留的时间没有显著差异，说明异甘草素不会显著影响小鼠的记忆力；免疫组化染色后观察到给药组VLPO等几个脑区c-fos蛋白的表达相较于对照组显著增加，说明这些脑区被激活。

图1 异甘草素促睡眠作用情况

图2 异甘草素对睡眠张力的影响

图3 异甘草素对小鼠记忆能力的影响

图4 异甘草素特异性激活的脑区

异甘草素能增加小鼠的NREM睡眠，说明异甘草素有很好的促睡眠作用和临床应用前景，然而目前该中药的药理作用和机制研究仍比较缺乏。例如长期使用异甘草素促睡眠是否对小鼠的其他机体功能产生有影响尚未可知。本研究只检测了小鼠的认知和记忆力，随着小鼠睡眠量的增加，会使活动量减少，有可能影响小鼠的正常生存状态，而且长期给药时还需要监测小鼠的血压和机能代谢功能，也需要进行毒理学和药代动力学试验。在免疫组化实验中将小鼠灌胃给药1 h后麻醉，使用心脏灌流的方法取小鼠全脑，染色后显示给药组小鼠的VLPO、VMPO、SFO、DR和VLPAG脑区的c-fos表达量显著高于对照组，但是在灌胃给药1 h之内，这些脑区是直接被异甘草素激活，还是通过机体体液调节间接激活也尚未可知。从VLPO的功能来看，进入睡眠时，VLPO脑区中的觉醒神经元被抑制，然而VLPO脑区里除了觉醒神经元之外还有中间神经元，异甘草素是直接抑制了觉醒神经元达到促睡眠的作用，还是作用于中间神经元间接影响了觉醒神经元尚不清楚，应该进一步研究。可以利用膜片钳技术，在离体脑片上给药来记录实验现象，来进一步研究异甘草素的作用机制。

动物实验和临床试验有些差异，动物实验是临床试验的基础。本研究的实验对象是C57小鼠，小鼠虽然是哺乳动物且与人类基因组相似率高达99%，但是仅这1%的差异让小鼠和人类在形体和昼夜节律上却截然不同，小鼠昼伏夜出，而且寿命只有2～3年。目前人类社会中老年人的睡眠缺乏问题较为严峻，该研究中使用的小鼠为2月龄，不是老年鼠，所以异甘草素在老年鼠身上的药物疗效尚未研究，需要进一步研究异甘草素对不同月龄的C57小鼠的促睡眠作用。由于动物和人类之间的差异，药物研究还需要考虑药物剂量问题，药物的副作用还需通过大量的动物实验来验证。