基因干扰m iR-105抑制非小细胞肺癌细胞的干细胞样特性、恶性增殖和侵袭

李纪远，马 新，张灿斌，王 献，郑帅玉，尚自强

肺癌的发病率是目前所有癌症类型中最高的，其中85%是非小细胞肺癌。超过50%的肺癌患者在确诊1年后死亡。肺癌晚期患者往往由于癌细胞从原发部位转移至远处器官导致预后不良和治疗失败。当前，化学疗法、放射疗法和靶向疗法是比较有效的肺癌治疗方法，但由于化疗药物耐药性，化学疗法的应用受到限制，因此进一步探究预防肺癌发生发展的可能靶点非常必要。

微小RNA是一大类内源性微小非编码RNA，长度为21～22个核苷酸，可调节约30%的人类基因表达。越来越多的证据表明，微小RNA可以作为癌基因和抑癌基因参与肿瘤的发展。microRNA-105（miR-105）与肝癌、结肠癌和卵巢癌的发生发展有着密切关系。已有研究表明 miR-105通过上调Mcl-1促进非小肺癌细胞的上皮-间质转化。能靶向负调控KIFC1抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。但miR-105对非小细胞肺癌的具体作用机制仍不清楚。该文旨在探究基因干扰miR-105对非小细胞肺癌细胞的干细胞样特性、恶性增殖和侵袭的影响，为靶向治疗非小细胞肺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培养基（货号：12100-046）、青链霉素（货号：15140-122）、胎牛血清（货号：26400-036）、胰蛋白酶（货号：15050-057）和F12培养基（货号：21700-075）购自美国Gibco公司；LipoRNAi转染试剂（货号：C0535）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012）购自上海碧云天生物技术研究所；Transwell（货号：3374）购自美国 Corning公司；Anti SOX2（货号；ab97959）、OCT4（货号：ab18976）、VEGF（货号；ab2350）、β-actin（货号：ab8227）购自英国 Abcam公司。

1.2 细胞培养

33例肺癌及癌旁组织来源于河南科技大学第一附属医院，所有涉及研究的标本取材均预先征得患者及家属知情同意，并经过医院伦理委员会批准，RT-PCR检测肺癌组织和癌旁组织中miR-105表达水平。人非小细胞肺癌细胞A549来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，将细胞培养于DMEM培养基中，添加10%胎牛血清和1%青链霉素，置于37℃含5% CO的培养箱中培养，每24 h更换新鲜培养基，1∶2传代。选用对数生长期细胞为实验用细胞。

1．3 RT-PCR

用TRIzol法从A549细胞中提取总RNA，用Nanodrop分光光度计测定吸光度值（A260／A280），按试剂盒说明书进行cDNA合成和PCR的扩增，反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，扩增 35个循环；72℃延长10min。存储在4℃条件下。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。

1.4 细胞处理及分组

取对数生长期的A549细胞1×10个／孔接种于6孔板，细胞密度达60%时，按LipoRNAi转染试剂说明书的方法将inhibitor-NC、miR-105 inhibitor转染至A549细胞，细胞分为：Control组、inhibitor-NC组和miR-105 inhibitor组。

1.5 成球实验

将各组细胞经流式细胞仪计数后铺至超低黏附96孔板。每孔100μl F12成球培养基，含10个活细胞，各铺10个复孔。静置培养14 d后倒置显微镜下观察成球率及成球直径。成球率＝每孔细胞球数目总和／每孔加入的细胞数×100%。

1．6 流式分选检测CD133

取对数生长期的A549细胞，0.01%PBS清洗2次后用0.25%胰酶消化，培养液终止，1 000 r／min离心10 min，弃去上清液，调整细胞密度为5×10个／ml。分别加入抗CD133抗体，用流式细胞仪进行检测。

1.7 克隆形成实验

在培养皿中培养细胞至大约30%汇合度，继续培养4 d，吹散为单个细胞，用6孔板培养，每孔约500个细胞，培养14 d，弃掉培养基，用乙醇固定30 min，接着用0.5%结晶紫染色，用去离子水漂洗晾干，进行拍照观察。

1．8 Transwell实验

取 300μl无血清培养基，4℃下加入60μl Matrigel，混匀，平均加入小室，置于37℃培养箱中孵育5 h，将100μl细胞用无血清培养基清洗3次，配成细胞悬液加入Transwell小室，下室中加入600μl含有20%胎牛血清的培养基，置于37℃培养箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS洗2次，5%戊二醛固定，0.1%结晶紫染色0.5 h后于荧光显微镜下观测。

1．9 Westernblot实验

收集各组细胞在冰上溶解25 min。以12 000 r／min离心10 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品（20 mg），在100℃条件下变性5 min。使用 SDSPAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4℃条件下加入相应一抗并孵育过夜，清洗，然后在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。ImageJ软件统计灰度值。

2 结果

2．1 不同组织miR-105的表达水平

收集33例肺癌病人肺癌组织样本，通过RT-PCR检测肺癌组织和癌旁组织中miR-105表达水平，结果如图1A所示，癌旁组织中miR-105表达水平低于癌组织；通过RT-PCR检测各组细胞miR-105表达水平，结果如图1B所示，与 Control组相比较，miR-105 inhibitor组 miR-105表达水平降低（F＝476.8，P＜0.05）。

图1 不同组织m iR-105表达水平

2．2 基因干扰miR-105对A549细胞成球率、成球直径影响

通过成球实验检测各组细胞成球率、成球直径，结果如图2所示，与Control组相比较，miR-105 inhibitor组细胞成球率、成球直径降低（F＝40.08、14.50，P＜0.05）。

2．3 基因干扰 miR-105对 A549细胞 SOX2、OCT4蛋白表达水平的影响

通过Western blot检测各组细胞SOX2、OCT4蛋白表达水平，结果见图3，与 Control组比较，miR-105 inhibitor组 SOX2、OCT4蛋白水平降低（F＝54.61、55.21，P＜0.05）。

2．4 基因干扰miR-105对A549细胞CD133细胞数的影响

通过流式分选检测各组细胞CD133细胞数，见图4，与 Control组比较，miR-105 inhibitor组CD133细胞数降低（F＝47.07，P＜0.05）。

图2 基因干扰m iR-105对A549细胞成球率、成球直径的影响

2．5 基因干扰miR-105对A549细胞增殖的影响

通过克隆形成实验检测各组细胞增殖情况，见图5，与 Control组相比较，miR-105 inhibitor组克隆形成率降低（F＝54.41，P＜0.05）。

图3 基因干扰m iR-105对A549细胞SOX2、OCT4蛋白表达水平的影响

图4 基因干扰m iR-105对A549细胞CD133＋细胞数的影响

图5 基因干扰m iR-105对A549细胞增殖的影响

2．6 基因干扰 miR-105对 A549细胞侵袭和

VEGF蛋白表达水平的影响

通过Transwell检测各组细胞侵袭，见图6A，与Control组相比较，miR-105 inhibitor组侵袭细胞数降低（F＝11.34，P＜0.05）；通过Western blot检测各组细胞VEGF蛋白表达水平，见图6B，与Control组相比较，miR-105 inhibitor组 VEGF蛋白水平降低（F＝18.48，P＜0.05）。

图6 基因干扰m iR-105对A549细胞侵袭和VEGF蛋白表达水平的影响

3 讨论

肺癌是全世界公认的高度侵袭性肿瘤，在中国肺癌的发病率和死亡率极高。随着科技的进步，早期诊断、手术治疗和靶向治疗已取得了巨大进展，但肺癌患者的预后仍然很差，其5年生存率仅为15%。新的肿瘤标记物和治疗靶点是未来肺癌诊断治疗的方向。研究表明microRNA在肺癌的病理进程中起重要作用，microRNA可用于肺癌的早期诊断及治疗。

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有自我更新能力的细胞，其可分化成为不同家族的肿瘤细胞构成整个肿瘤。肿瘤细胞获得干细胞表型后具有较强的成球能力，并分化成其他类型的肿瘤细胞，肿瘤干细胞表型的获得是恶性肿瘤重要的生物学特性，也是肿瘤复发的重要因素之一。研究表明肺癌的发生发展、复发、转移、抗辐射以及耐药性等恶性表型特征都与肺癌干细胞相关。SOX2与OCT4作为癌症干细胞标志物，在维持干细胞多能性方面起着重要作用，其参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移、耐药、复发等过程。CD133是肿瘤干细胞标志物，在肺癌干细胞的分离、纯化中具有重要作用，与肺癌细胞耐药、预后及靶向治疗密切相关。夏凡等研究提示 miR145通过下调 OCT4表达抑制A549细胞干细胞特性。本研究表明基因干扰miR-105具有降低A549细胞成球率、成球直径和CD133细胞数，下调 A549细胞 SOX2、OCT4蛋白表达水平的作用，提示基因干扰miR-105表达可抑制A549干细胞样特性。

肺癌细胞的增殖、侵袭是影响肺癌预后及病情转归的重要生物学行为。抑制肺癌细胞增殖和侵袭是治疗肺癌的重要方式。肺癌细胞的增殖、侵袭受到细胞内多种基因的调控。血管生成是肿瘤发展的特征，VEGF在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，通过刺激肺血管内皮细胞分化增殖和迁移、提高血管通透性、浸润淋巴管等促进肺癌的进展和转移。谢易等研究表明miR-105在骨关节炎中通过负向调控FUT4影响骨关节炎软骨细胞的增殖和凋亡。Liu et al研究提示miR-105上调通过直接靶向 SOX9的 mRNA并抑制下游 TCF4、c-MYC、Cyclin D1和AXIN2蛋白表达来抑制增殖和侵袭并诱导胶质瘤细胞凋亡。该研究表明基因干扰miR-105具有抑制A549细胞增殖、侵袭和下调VEGF蛋白表达水平的作用。

综上所述，该研究表明基因干扰miR-105对A549细胞干样特性、增殖和侵袭的影响：降低成球率、成球直径和 CD133细胞数，下调 A549细胞SOX2、OCT4蛋白表达水平，抑制A549细胞增殖、侵袭和下调VEGF蛋白表达水平。该文为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了一定的实验依据。