牛蒡甙元对老年大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

柯筱玥，黄梦娇，杜恒健，刘 尧，朱 颖，方 靖，韩雪娇

肾缺血再灌注损伤是急性肾脏损伤的常见发病机制，因为肾脏是高度灌注的器官，并且对缺血非常敏感。许多因素均可导致肾脏缺血再灌注损伤，如肾脏血管外科手术、肾脏移植、心脏骤停、低血压和休克。肾缺血再灌注损伤的发病机制复杂且难以治疗，因此有必要进一步了解导致肾缺血再灌注损伤或防止肾缺血再灌注损伤造成损害的分子机制。牛蒡甙元是从牛蒡中提取的一种苯丙素二苄基丁内酯木酚素，是中药牛蒡的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗增殖和抗糖尿病等生物活性。相关研究表明牛蒡甙元具有抗肾炎作用，能有效治疗急性肾炎和肾病综合征，通过降低尿蛋白、尿微量白蛋白及肾脏转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）mRNA的表达对糖尿病大鼠肾脏病变有一定的改善，证明了牛蒡甙元的肾保护作用，目前还没有牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤具体作用机制的报道。该文旨在探究牛蒡甙元对老年大鼠肾缺血再灌注损伤模型的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SD大鼠购自成都达硕实验动物有限公司，雄性，18月龄，体质量（430±15）g，许可证号：SYXK（川）2014-189，置于温控（22±1）℃和光控（200 lux，12 h／12 h光暗循环）动物设施中常规饲养7 d。

1.2 试验药物和主要试剂

牛蒡甙元（SMB00075）购自美国 Sigma-Aldrich，化学式：C21H24O6，分子量：372.41，纯度≥95%；苏木精 -伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液（批号：D006-1-1）购自南京建成生物工程研究所；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1091）购自上海碧云天生物技术研究所；抗肾损伤分子1（kidney injury molecule 1，KIM-1）（批 号：ab241711）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutropil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）（批号：ab63929）、cleaved caspase-3（批号：ab2302）、cleaved caspase-9（批号：ab2324）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批号：ab6671）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（批号：ab100772）、白细胞介素-8（interleukin-6，IL-8）（批号：ab7747）、PI3K（批号：ab191606）、p-PI3K（批号：ab182651）、Akt（批号：ab106693）、p-Akt（批号：ab192623）、GAPDH（批号：ab9485）购自美国 Abcam公司；LY294002（批号：S110525）购自美国selleck公司。

1.3 动物模型建立与分组

采用随机数字表法将大鼠随机分为6组：假手术组（Sham组）、牛蒡甙元组（ACR组）、肾缺血再灌注模型组（RIRI组）、RIRI＋ACR（10 mg／kg）组、RIRI＋ACR（20 mg／kg）组和RIRI＋ACR（50 mg／kg）组。麻醉所有大鼠，对所有大鼠进行中线剖腹手术和右肾切除术，暴露左肾，Sham组和ACR组不做处理，其余各组用非创伤性血管钳夹紧左肾动脉，诱导缺血1 h，松开动脉后，再灌注24 h。缝合切口后 ACR组、RIRI＋ACR（10 mg／kg）组、RIRI＋ACR（20 mg／kg）组、RIRI＋ACR（50 mg／kg）组分别灌胃牛蒡甙元 50 mg／kg、10 mg／kg、20 mg／kg、50 mg／kg。其余各组灌胃等量0.9%氯化钠溶液，每日1次，连续7 d。7 d后处死各组所有大鼠。

1.4 试剂盒检测大鼠血肌酐、尿素氮

根据试剂盒说明书，采用可见分光光度计测定大鼠血肌酐（serum creatine，Scr）、尿素氮（BUN）水平。在 546 nm处测Scr吸光度值，在640 nm处测BUN吸光度值。

1．5 苏木精-伊红（HE）染色

取各组大鼠肾组织先用10%甲醛固定48 h，然后石蜡包埋制作呈切片，切片5 mm厚。然后进行HE染色。在400×荧光显微镜下观察肾组织损伤情况。

1．6 TUNEL染色

大鼠肾组织切片用二甲苯浸洗2次脱蜡，每次5 min，梯度乙醇脱水。用蛋白酶K工作液在37℃下封闭20 min，PBS清洗2次。在每个切片样本上加入50μl TUNEL反应液，37℃闭光反应60 min。用DAPI复染10 min后荧光显微镜下观察。

1．7 ELISA检测 TNF-α、IL-6、IL-8水平

在 4℃下用50 mmol／L的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，100 μl／孔到96孔酶标板，将抗原包被过夜，弃去包被液，用磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered saline tween-20，PBST）洗涤 3次，每次 5 min，每孔加 150 μl 1%BSA封闭1 h，PBST洗涤3次，加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 h，PBST洗涤5次，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤5次后显色剂显色20 min，用酶标仪在450 nm处测定TNF-α、IL-6、IL-8水平。

1．8 Westernblot实验

收集各组大鼠肾组织细胞并在冰上溶解25 min。以12 000 r／min离心10 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品（20 mg），在100℃条件下变性5 min。然后使用SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4℃条件下加入相应一抗并孵育过夜，清洗，然后在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。ImageJ软件统计灰度值。

2 结果

2.1 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型肾功能的影响

试剂盒检测各组大鼠Scr、BUN水平结果如图1A、1B所示，与Sham组比较，ACR组Scr、BUN水平相近，差异无统计学意义；RIRI组大鼠 Scr、BUN水平升高（t＝2.013、1.559，P＜0.01）。与 RIRI组比较，RIRI＋ACR（20 mg／kg）组大鼠 Scr、BUN水平降低（t＝7.692、5.701，P＜0.05），RIRI＋ACR（50 mg／kg）组大鼠 Scr、BUN水平降低（t＝2.831、1.825，P＜0.01）。HE染色检测各组大鼠肾病理损伤结果如图1C所示，Sham组及ACR组肾组织结构完整，肾间质无水肿充血；RIRI组可见肾脏组织病理性形态学变化，肾小球体积增大、系膜增生，间质区可见淋巴细胞浸润，肾小球细胞呈空泡变性；RIRI＋ACR（10、20、50 mg／kg）组较 RIRI组病理损伤程度减轻。Western blot检测各组大鼠肾损伤分子1（kidney injury molecule 1，KIM-1）、NGAL蛋白表达水平结果如图1D所示，与Sham组比较，ACR组KIM-1、NGAL蛋白水平差异无统计学意义，RIRI组大鼠 KIM-1、NGAL蛋白水平升高（t＝1.037、1.083，P＜0.01）；与 RIRI组比较，RIRI＋ACR（20 mg／kg）组大鼠 KIM-1、NGAL蛋白水平降低（t＝6.328、4.839，P＜0.05），RIRI＋ACR（50 mg／kg）组大鼠 KIM-1、NGAL蛋白水平降低（t＝1.332、1.255，P＜0.01）。

图1 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型肾功能的影响

2.2 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型凋亡的影响

TUNEL染色检测各组大鼠凋亡情况如图2A所示，心肌凋亡细胞呈绿色，细胞核呈蓝色，RIRI组较Sham组凋亡细胞数增多，RIRI＋ACR（20、50 mg／kg）组凋亡细胞数较 RIRI组减少。Western blot检测各组大鼠cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达水平结果如图1D所示，与Sham组相比较，ACR组 cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平差异无统计学意义，RIRI组大鼠cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平升高（t＝1.407、1.476，P＜0.01）；与 RIRI组相比较，RIRI＋ACR（20 mg／kg）组大鼠 cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平降低（t＝3.063、3.105，P＜0.05），RIRI＋ACR（50 mg／kg）组大鼠 cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平降低（t＝1.708、1.690，P＜0.01）。

图2 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型凋亡的影响

2．3 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型TNF-α、IL-6、IL-8水平的影响

ELISA检测各组大鼠炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8水平，结果见图3。与Sham组相比较，ACR组 TNF-α、IL-6、IL-8水平差异无统计学意义，RIRI组大鼠 TNF-α、IL-6、IL-8水平升高（t＝1.471、1.965、1.624，P＜0.01）。与 RIRI组相比较，RIRI＋ACR（20 mg／kg）组大鼠 TNF-α、IL-6、IL-8水平降低（t＝4.167、4.623、4.837，P＜0.05），RIRI＋ACR（50 mg／kg）组大鼠 TNF-α、IL-6、IL-8水平降低（t＝1.835、2.088、2.213，P＜0.01）。

图3 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型TNF-α、IL-6、IL-8水平的影响

2．4 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值的影响

Western blot检测各组大鼠 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平结果见图4。与 Sham组相比较，ACR组p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值差异无统计学意义，RIRI组大鼠 p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值降低（t＝1.458、1.271，P＜0.01）。与 RIRI组相比较，RIRI＋ACR（20 mg／kg）组大鼠 p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值升高（t＝1.846、1.485，P＜0.05），RIRI＋ACR（50 mg／kg）组大鼠 p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值升高（t＝1.512、1.302，P＜0.01）。

图4 牛蒡甙元对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平的影响

2．5 PI3K／Akt通路抑制剂LY294002对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型的影响

加入PI3K／Akt通路抑制剂LY294002后，Western blot检测各组大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平结果见图5A。与Sham组相比较，RIRI组大鼠p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值降低（t＝1.458、1.271，P＜0.01）。与 RIRI组相比较，RIRI＋ACR（50 mg／kg）组p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比 值 升 高 （t＝1.512、1.302，P＜0.01），RIRI＋LY294002组 p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值降低（t＝3.400、2.200，P＜0.05），RIRI＋ACR＋LY294002组 p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值高于 RIRI＋LY294002组（t＝2.333、1.667，P＜0.05）。加入 PI3K／Akt通路抑制剂LY294002后 Scr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-8水平见图5B、5C、5D、5E、5F所示，与 Sham组相比较，RIRI组大鼠 Scr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-8水平升高（t＝2.013、1.559、1.471、1.965、1.624，P＜0.01）。与RIRI组相比较，RIRI＋ACR（50 mg／kg）组 Scr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-8水平降低（t＝2.831、1.825、1.835、2.088、2.213，P＜0.01），RIRI＋LY294002组Scr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-8水平升高（t＝4.645、3.784、7.819、14.244、27.605，P＜0.05）。RIRI＋ACR＋LY294002组 Scr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-8水平低于 RIRI＋LY294002组（t＝4.224、3.046、5.861、7.852、8.064，P＜0.05）。

图5 PI3K／Akt通路抑制剂LY294002对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型的影响

3 讨论

肾缺血再灌注损伤是临床用药潜在的毁灭性的病理生理发展，往往在住院患者中遇到，其死亡率约为50%～80%。目前尚无有效的肾缺血再灌注损伤治疗策略，对其治疗仍然依赖于药物疗法。但是，肾缺血再灌注损伤的药物治疗一直产生不良的治疗效果。老年人的肾脏功能由于老化处于临界状态，遇特殊状态容易导致急性肾功能衰竭，引起缺血再灌注损伤。

Scr和BUN是肾功能恢复的关键评估因素，其浓度可直接反应肾小球滤过率，肾功能损伤时Scr和BUN的浓度会增加，故通过这两个指标的变化可间接反映肾功能损伤的情况。KIM-1是近年发现的黏附因子蛋白，位于近曲小管上皮细胞膜上，与肾小管上皮再生有关，属于免疫球蛋白超家族，其表达具有高度的组织特异性，与肾小管损伤程度密切相关，在肾损伤及恢复过程中持续增高，因此其水平可以反映肾小管损伤的程度。NGAL是一种小分子量的分泌蛋白，在缺血引起的肾损伤中表达上调。该研究表明，牛蒡甙元具有降低肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型Scr和BUN的水平，改善肾组织病理损伤程度，下调KIM-1、NGAL蛋白表达水平的作用。该研究结果提示牛蒡甙元可改善肾功能。

细胞凋亡是缺血再灌注组织和器官损伤的途径之一，肾脏缺血再灌注时主要是肾小管上皮细胞发生凋亡，且以肾小管远端的上皮细胞的凋亡最为明显。caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，可以通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡，其中caspase-9、caspase-3在凋亡级联中过度活化能够促进细胞凋亡。该文研究表明牛蒡甙元具有下调肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平的作用。结果提示牛蒡甙元有抑制细胞凋亡作用。

炎症是缺血再灌注损伤的突出特征，其特征在于白细胞浸润和肾小管损伤。相关研究表明，在缺血再灌注的情况下，TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症标志物的水平显着升高，从而刺激了各种内皮黏附分子的活化。这扰乱了肾脏的微循环，并导致肾小管上皮受损，触发肾小管坏死，最终导致肾脏损害或损伤。IL-8参与了早期肾缺血再灌注过程，在炎症中具有促炎作用。Lee et al研究表明牛蒡甙元对LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7可呈时间剂量依赖性地抑制 NO及炎性因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2的分泌。Wu et al研究提示牛蒡甙元通过降低丙二醛、IL-6和TNF-α水平，进而改善膜性肾小球肾炎病症。该文研究显示牛蒡甙元具有降低肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型TNF-α、IL-6、IL-8。结果提示牛蒡甙元通过抑制炎症因子改善肾缺血再灌注损伤。

PI3K／Akt信号通路参与调节细胞凋亡、增生、分化和代谢等一系列生理活动。PI3K信号级联可能导致多个内源性的保护细胞途径来减少缺血再灌注后的组织细胞损伤。Wang et al研究表明牛蒡甙元可在分子水平通过下调雄激素受体通路和PI3K／Akt通路表达抑制前列腺癌细胞的生长增殖。Chang et al研究提示牛蒡甙元通过 PI3K／Akt通路改善蛛网膜下腔出血诱导的血管痉挛。该研究显示牛蒡甙元具有升高肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型 p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt比值的作用，提示牛蒡甙元通过PI3K／Akt通路对肾缺血再灌注损伤老年大鼠模型具有保护作用，且加入PI3K／Akt通路抑制剂LY294002，证实了这一作用。