基于SREBP-2／Lipin1轴调控的线粒体途径探讨糖尿病周围神经病变的发生机制

肖丽霞，柯瑞琼，王 瑒，郭 莉，洪世华，吕维名

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病（diabetic mellitus，DM）最常见的慢性并发症之一，起病隐匿，进展缓慢，以感觉神经受累最为常见。在糖尿病确诊后10年内，有60%～90%患者有不同程度的神经病变，是糖尿病患者致残的主要原因。DPN发病机制复杂，涉及多元醇通路激活、氧化应激、线粒体功能障碍、糖基化终末产物堆积、神经营养改变、蛋白激酶 C（PKC）途径激活等。线粒体是机体细胞能量代谢的重要场所，高血糖导致的线粒体氧化应激反应在DPN的发病机制中发挥重要作用。在周围神经系统中，细胞间液高糖会导致能量代谢异常，造成周围神经侧芽及轴突再生修复障碍。固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）是脂质代谢的关键转录因子，包括两种异构体SREBP-1和SREBP-2，可调控脂肪酸和胆固醇的合成。脂素（Lipin1）是一种新的脂肪因子，参与调节脂肪垫以及雪旺细胞中的磷脂酸磷酸酯酶活性，缺乏Lipin1会导致磷脂酸磷酸酯酶活性不足，神经传导速度减慢，进而引发周围神经病变。目前关于 SREBPs、Lipin1与 DPN发病机制的相关研究相对较少，该研究从新的脂肪因子角度出发，探索DPN大鼠坐骨神经病变可能的作用机制，为DPN的临床治疗寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 动物

60只成年雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。按照动物实验伦理学指导给予动物人文关怀，实验前适应性饲养1周，自由摄取食水。

1.2 试剂

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma公司）；GHb（微柱法）试剂盒（美国泰康公司）；活性氧（reactive oxyopen species，ROS）检测试剂盒（北京华英生物技术研究所）；SREBP-2-siRNA、Lipin1慢病毒载体及空载体（上海吉凯基因化学技术有限公司）；羊抗大鼠SREBP-2、Lipin1、B淋巴细胞瘤2蛋白（Bcl-2）及 Bcl-2相关X蛋白（Bax）、细胞色素 C（cytochrome C，Cyto C）、β-actin抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.3 仪器

Mac／Lab400生理数据记录系统（澳大利亚ADI公司）；血糖仪和血糖试纸（美国强生公司）；线粒体膜电位 JC-1试剂（北京康宝莱科技有限公司）；流式细胞仪（美国 Beckman Coulter公司）；荧光酶标仪（美国BioTek公司）。

1.4 实验造模

适应性饲养1周，将大鼠随机分为2组：正常对照组20只，给予标准饲料；模型对照组40只，给予高糖高脂饮食（含66.5%普通词料，20%蔗糖，10%猪油，2.5%胆固醇，1%猪胆盐）。8周后按30 mg／kg剂量腹腔内一次注射浓度为1%的STZ溶液（称取1 g STZ粉剂加入0.1 mol／L柠檬酸钠缓冲液100 ml中，现用现配）制备糖尿病大鼠模型，注射72 h后，禁食禁水12 h，大鼠尾静脉采血，血糖仪检测空腹血糖，血糖＞16.7 mmol／L者为造模成功，待DM模型建立后，继续饲养6周，检测大鼠尾部坐骨神经传导速度（sciatic nerve conduction velocity，SNCV），以SNCV＜30 m／s为DPN模型成功。

1.5 实验分组及处理

取10只大鼠作为正常对照组，另外取30只DPN模型大鼠，随机分为空白对照（NC）组、Lipin1过表达（LV-Lipin1）组、SREBP-2-siRNA（si-SREBP-2）组，每组10只。后三组通过尾静脉分别注射si-SREBP-2空慢病毒载体（2×10TU／ml）5×10TU、Lipin1慢病毒载体（1.7×10TU／ml）5×10TU及 si-SREBP-2，每月1次，连续2次，8周后结束实验，断头处死大鼠，迅速分离并取双侧坐骨神经（在膝关节上方取长约4 cm的坐骨神经干），入液氮保存待测。

1.6 指标测定

1.6.1 记录各组小鼠空腹血糖水平 处死前尾静脉采血，采用血糖仪和血糖试纸测定血糖水平，微柱法检测糖化血红蛋白（hemoglobin Alc，HbAlc）浓度。

1.6.2 大鼠SNCV 大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（300 mg／kg）麻醉，俯卧位固定，暴露并分离右侧坐骨神经，使用Mac／Lab400生理数据记录系统，通过诱发电位测定各组大鼠潜伏期、坐骨神经传导速度和振幅。

1.6.3 坐骨神经线粒体膜电位 取坐骨神经制备单细胞悬液，取100μl细胞悬液置于5 ml的流式测定管，加入100μl JC-1工作液，轻轻混匀，阴性对照管不加，于37℃培养箱中孵育20 min，加入500μl PBS缓冲液，上机检测，以红／绿荧光强度比值（R1／R2）衡量线粒体膜电位去极化比例。

1.6.4 ROS检测 取50 mg坐骨神经，加入1 ml匀浆缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆。3 600 r／min、4℃离心10 min，弃沉淀，取上清液。在96孔板中加入190μl匀浆上清液、10μl DHE探针，用移液器吹打，使之充分混匀；在37℃避光孵育30 min；置于荧光酶标仪中，后于激发波长为488～535 nm、发射波长610 nm检测荧光强度。以荧光强度／毫克蛋白表示组织ROS强度。

1.6.5 检测 SREBP-2、Lipin1、Bcl-2、Bax、Cyto C表达变化 取100 mg坐骨神经，加入适量裂解液于冰浴充分裂解，4℃离心30 min，吸取上清液，采用BCA试剂盒测量蛋白质含量。取少量蛋白质制成上样缓冲液，进行电泳、转膜、封闭后，加入一抗SREBP-2、Lipin1、Bcl-2、Bax、Cyto C、β-actin，4℃过夜。TBST洗涤，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温轻摇1 h，TBST充分洗涤，用 ECL化学发光试剂显色后，化学发光仪成像。

2 结果

2．1 造模后DPN大鼠坐骨神经ROS含量变化

与正常对照组比较，DPN组大鼠ROS含量升高（P＜0.01）。

图1 DPN大鼠坐骨神经ROS含量

2．2 造模后大鼠坐骨神经SREBP-2、Lipin1蛋白表达变化

与正常对照组比较，DPN组大鼠坐骨神经组织SREBP-2蛋白表达升高（P＜0.01），Lipin1蛋白表达下降（P＜0.01）。见图2。

图2 DPN大鼠坐骨神经SREBP-2、Lipin1蛋白表达

2．3 转染 SREBP-2、Lipin1后坐骨神经组织中SREBP-2、Lipin1表达结果

与NC组比较，转染SREBP-2、Lipin1后模型组大鼠坐骨神经中SREBP-2蛋白表达下降（P＜0.01），Lipin1蛋白表达升高（P＜0.01）。见图3。

图3 转染SREBP-2、Lipin1后坐骨神经组织中SREBP-2、Lipin1表达（±s，n＝10）

2．4 调节SREBP-2、Lipin1表达后对大鼠尾尖血糖的影响

与正常对照组比较，NC组大鼠空白血糖和HbAlc水平升高（P＜0.01）；与 NC组比较，si-SREBP-2、LV-Lipin1组大鼠血糖和HbAlc水平均降低（P＜0.01）。见表1。

表1 调节SREBP-2、Lipin1表达后对大鼠尾尖血糖的影响（±s，n＝10）

2．5 调节 SREBP-2、Lipin1表达后SNCN变化

与正常对照组相比，NC组大鼠SNCV减慢（P＜0.01）；与NC组大鼠相比，si-SREBP-2组、LV-Lipin1组大鼠 SNCV加快（P＜0.01）。见表2。

表2 调节SREBP-2、Lipin1表达后对大鼠SNCN的影响（±s，n＝10）

2．6 调节SREBP-2、Lipin1表达后大鼠坐骨神经线粒体膜电位变化

与正常对照组比较，NC组大鼠坐骨神经线粒体膜电位降低（P＜0.01）；与NC组大鼠相比，si-SREBP-2、LV-Lipin1组大鼠坐骨神经线粒体膜电位升高（P＜0.01）。见图4。

图4 调节SREBP-2、Lipin1表达后对大鼠坐骨神经线粒体膜电位的影响

2．7 调节SREBP-2、Lipin1表达后大鼠坐骨神经ROS含量变化

与正常对照组比较，NC组大鼠坐骨神经ROS含量升高（P＜0.01）；与NC组大鼠相比、si-SREBP-2、LV-Lipin1组大鼠坐骨神经ROS含量降低（P＜0.01）。见图5。

图5 调节SREBP-2、Lipin1表达后对大鼠坐骨神经ROS含量的影响

2．8 调节SREBP-2、Lipin1表达后大鼠坐骨神经中CytoC、Bcl-2、Bax表达变化

与正常对照组比较，NC组大鼠坐骨神经中Cyto C、Bcl-2水平降低，同时Bax蛋白水平增加 （P＜0.01）；与 NC组比较，si-SREBP-2、Lipin1组大鼠坐骨神经中Cyto C、Bcl-2水平升高，同时Bax蛋白水平下降（P＜0.01）。见图6。

图6 调节SREBP-2、Lipin1表达后对大鼠坐骨神经中Cyto C、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

3 讨论

DPN是糖尿病常见的慢性并发症之一，而且随着糖尿病病程的增加，DPN的发病率也逐渐升高。DPN发病机制较为复杂，其中以线粒体相关的氧化应激是核心因素。SREBP-2参与调节葡萄糖代谢相关酶基因的表达及三酰甘油、脂肪酸的合成，有研究显示 SREBP-2参与糖尿病脂质性肾病的发生，但关于其在DPN方面的研究鲜有报道。Lipin1通过调控磷脂酸磷酸酯酶活性参与髓磷脂的合成，Lipin1缺乏会造成髓磷脂合成减少，神经传导速度减慢，是造成周围神经病变的原因之一。

高血糖诱导的氧化应激是通过线粒体途径来诱导细胞凋亡的，线粒体膜电位下降会增加线粒体的通透性，线粒体中的凋亡蛋白释放到胞质中，启动细胞的凋亡程序。高血糖会先引起线粒体膜电位超极化，该过程产生的大量ROS，导致细胞产生氧化应激损伤。

本实验以高糖高脂饮食结合腹腔注射STZ成功诱导DPN模型，造模后DPN组大鼠坐骨神经组织ROS含量、SREBP-2蛋白表达升高，Lipin1蛋白表达下降，说明糖尿病大鼠的周围神经病变可能与ROS含量、SREBP-2、Lipin1的表达变化有关。为进一步探讨其发生机制，本研究通过慢病毒高表达载体和小干扰RNA转染方法对DPN大鼠进行干预，结果显示si-SREBP-2组和LV-Lipin1组大鼠尾尖血糖明显降低，坐骨神经传导速度明显加快，结果表明其周围神经病变得到改善。进一步检测线粒体损伤，结果表明DPN模型组大鼠ROS含量明显升高，线粒体膜电位下降，Cyto C、Bcl-2水平降低，同时Bax蛋白水平增加 （P＜0.01）；而 si-SREBP-2、LVLipin1组大鼠ROS含量升高，线粒体膜电位显著升高，Cyto C、Bcl-2水平升高，同时Bax蛋白水平下降（P＜0.01）。以上结果表明调节 SREBP-2、Lipin1表达可能是通过抑制氧化应激、减少细胞凋亡来改善DPN大鼠周围神经组织损伤。

综上所述，DPN大鼠坐骨神经中存在 SREBP-2、Lipin1表达异常，调节SREBP-2、Lipin1表达后可改善DPN大鼠坐骨神经线粒体损伤和氧化应激反应，提示DPN的发生机制与SREBP-2／Lipin1调控的线粒体途径有关。