幼羊颅骨缺损修复中LncRNA的差异性表达及作用

刘 岩，邵 国*，张春阳

颅骨缺损修补是神经外科的一个难题，多种因素可以影响缺损区颅骨的生长。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）能与 DNA、RNA、蛋白质结合形成由LncRNA参与的复杂的基因表达调控网，进而参与骨损伤后的修复。Bu et al发现LncRNA t6通过下调miR-30a-5p，促进颗粒诱导的成骨细胞凋亡。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是一种由骨细胞分泌的磷酸酯酶，在骨组织广泛存在。骨钙素（osteocalcin，OCN）可间接反映成骨细胞的活跃水平。ALP、OCN的含量反应机体骨组织的代谢情况。在颅骨组织损伤时，骨的吸收和代谢因子发生变化，如血清 ALP、OCN等。然而在幼羊颅骨缺损再生中ALP、OCN的表达情况还没有被明确。

该研究通过测序探究在原生、新生骨组织中LncRNA的差异性表达与其联系的MicroRNA、Wnt／β调控骨生长的关系，确定差异性表达的LncRNA在幼羊颅骨缺损修复表达调控的意义，为临床上颅骨缺损的治疗提供新的理论基础。

1 材料与方法

1．1 实验动物及试剂、仪器

普通级雄性1月龄小尾寒羊12只，体质量（5.5±0.5）kg，来源于内蒙古科技大学包头医学院动物实验室[SCXK（蒙）K2016-0003]，无菌手术在内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院中心实验室[SYXK（蒙）K 2005-0019]进行，动物实验由内蒙古科技大学包头医学院医学生物学研究所动物实验伦理审查委员会通过，伦理审批IACUC号：2016-033。

RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂（PMSF）购于上海碧云天生物技术有限公司（货号：P0013C，ST505）；兔源 Wnt（货号：1243243-89-1）、β-catenin（货号：ab6302）、β-actin（货号：ab8227）抗体购于美国 Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒（货号：A53225）购于美国Thermo公司；ECL化学发光显色试剂盒（货号：P1010）购于北京普利莱公司；反转录试剂盒、ODSM、UCA1、H19、MEG3和内参 β-actin基因引物购于上海生物工程股份有限公司；Real-time PCR MasterMix荧光探针购于南京博尔迪公司；SYBR Green荧光染料（美国TaRaKa公司）；超声波破碎仪（型号：FB 505220）购于上海睿安生物科技有限公司；全自动化学发光成像分析系统（型号：Tanon 5800）购于北京中西远大科技有限公司；酶标仪（型号：MultiskanFC）、实时荧光定量 PCR仪（型号：ABI7900HT）、ABI7900荧光定量 PCR扩增仪（型号：ABI7900HT FAST）购于美国Thermo公司。

1．2 实验方法

建立幼羊颅骨缺损模型，12只1月龄的小尾寒羊分成2组：原生骨组织组、新生骨组织组，每组6只，按照1 ml／kg的剂量给予幼羊注射戊巴比妥钠，待完全麻醉后，俯卧固定于手术台，去除表皮上的毛发，碘伏、乙醇消毒，在颅骨中线部位切开颅骨表面皮肤，暴露颅骨，分离骨膜，用铣刀在中线部位切一直径为3 cm大小的颅骨，不要损伤硬脑膜，建立颅骨缺损模型（原生骨组只给予颅骨表面皮肤切开），双氧水和庆大霉素反复冲洗手术区域防止感染，缝合头皮（图1）。术后每只羊给予青霉素320万U，早晚各1次肌肉注射，连续给药5～7 d后拆线。1个月后分别取缺损区新生的骨组织及其邻近的原生骨组织置于事先做好标记的冻存管中，储存在-80℃的冰箱中备用。部分样品送至南京派森诺基因科技有限公司测序。

图1 幼羊颅骨缺损模型

1．3 ELISA检测血清ALP、OCN的含量

使用酶联免疫吸附法在建立颅骨缺损模型前对2组幼羊进行血清ALP、OCN含量的检测，模型组完成建立模型3个月后，再对2组幼羊进行ALP、OCN含量的检测。羊的颈静脉位于臂头肌和胸头肌构成的颈静脉沟内，对其周围进行去毛、消毒，入针点通常选择在颈部中部偏上。取血完毕后静置2 h取上清液-80℃冻存。进行后续检测。

1．4 Westernblot检测 Wnt、β-catenin蛋白的差异性表达

研磨每组的骨组织，加入裂解液及蛋白酶抑制剂，于冰上裂解30 min，BCA法对其进行蛋白定量，计算每孔的加样体积，10%SDS-PAGE凝胶电泳2 h，将样品转移至PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭2 h，剪出目的条带及内参，加入一抗Wnt、β-catenin、β-actin（1∶1 000）工作液于4℃过夜，第2天加入HRP标记的羊抗兔二抗于室温孵育2 h，ECL化学发光显示蛋白条带，使用Image J计算蛋白条带灰度值。

1．5 荧光定量PCR验证差异性表达

取出冻存的骨组织，研磨后，用TRIzol法提取总的RNA，Nanodrop 2000测定 OD、OD、OD的值计算纯度，OD／OD在1.8～2.2之间，OD／OD在 2.0～2.2之间可用于实验。按照试剂盒进行反转录，采用ABI7900型荧光定量PCR仪，SYBR Green荧光染料（美国TaRaKa公司）为PCR反应原料，反应体系参考说明书。利用Prime 5软件设计定量PCR所需引物及内参序列，引物序列UCA1：（上游）5′-TTTATGCTTGAGCCTTG-3′，（下游）5′-CTTGCCTGAA ATACTTG-3′；MEG3：（上游）5′-ATAGCGCCCCCTAT TCATGC-3′，（下 游）5′-GGGAGCAGCTATGGATCA CC-3′；H19：（上游）5′-CGTAGCAGTGACGAATGTG G-3，（下游）5′-TCTCATTGCCGAACACCT-3′；ODSM：（上 游）5′-GCUCUCUCCCUGACUGUUATT-3′，（下游）5′-UAACAGUCAGGGAGAGAGCTT-3′；β-actin：（上 游）5′-TGGCGTGTAAAGTCACCACC-3′，（下游）5′-CGAGCTCTGAGCACTGGAGA-3′，引物由上海生物工程科技有限公司合成，以 β-actin为内参，2方法计算相对差异表达。

2 结果

2．1 原生骨、新生骨组织样品间LncRNA表达水平相关性检测

样品间LncRNA表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标，在做差异表达分析之前，应先检查样品间LncRNA的表达水平相关性。本研究用皮尔逊相关系数表示样品间LncRNA的表达水平相关性，相关系数大于0.9，见图2。提示样品间LncRNA的表达水平相关性较好。

图2 样品相关性检验

2．2 LncRNA差异分析结果

采用 DESeq对LncRNA表达进行差异分析，筛选差异表达基因条件为｜log（表达量差异倍数）｜＞1且P＜0.05。不同分组之间的LncRNA差异表达统计结果显示，在原生骨组织组与新生骨组织组中共计有171个基因发生变化，其中有95个LncRNA被上调，76个LncRNA被下调。

2．3 LncRNA表达差异分析比较

在所有表达差异的 LncRNA中，选取 LncRNA ODSM、LncRNA H19、LncRNA UCA1、LncRNA MEG3等差异明显的基因进行验证RNA的表达量，RT-PCR检测的结果显示，与原生骨组织组相比，新生骨组织组中LncRNA ODSM的表达升高且差异有统计学意义（t＝5.000，P＜0.01）、LncRNA UCA1表达上升且差异具有统计学意义（t＝7.205，P＜0.01）（图3A、3B）。而与原生骨组织组相比，新生骨组织组中LncRNA H19的表达降低且差异具有统计学意义（t＝7.412，P＜0.01）、LncRNA MEG3表达降低且差异具有统计学意义（t＝6.482，P＜0.01）（图 3C、3D）。Realtime PCR结果与高通量测序结果相符。

图3 Real-time PCR检测lncRNA表达

2．4 MicroRNA表达变化的分析

通过之前的测序结果显示miRNA-139b-3p的表达在两组实验中有差异，根据｜log（表达量差异倍数）｜＞1且P＜0.05进行筛选表明miRNA-139b-3p表达量有差异，再进行RT-PCR验证，结果显示原生骨组织中miRNA-139b-3p的相对丰度值为（0.065±0.014），新生骨组织中miRNA-139b-3p的相对丰度值为（0.175±0.036）。新生骨组织内的miRNA-139b-3p的表达水平高于原生骨组织（t＝6.399，P＝0.000 2）。

2．5 血清ALP、OCN表达结果

分别对两组幼羊进行血清ALP、OCN含量的检测，结果显示，原生骨组织中ALP的含量为（59.13±10.06）、OCN的含量为（79.29±9.36），在建立颅骨缺损模型前，2组幼羊的血清ALP、OCN含量差异不具有统计学意义（P＞0.05），而模型组建立3个月后，比较血清 ALP、OCN的含量：与原生骨组织组相比，新生骨组织组血清的ALP含量（87.73±12.25）升高且差异具有统计学意义（t＝4.420，P＜0.01），新生骨组织组血清的OCN含量（108.89±15.70）升高且差异具有统计学意义（t＝3.967，P＜0.01）。

2．6 骨组织中 Wnt、β-catenin蛋白表达

Western blot检测表明，与原生骨组织组相比，新生骨组织组中Wnt蛋白的表达升高且差异具有统计学意义（t＝4.038，P＜0.01）。与原生骨组织组相比，新生骨组织组中β-catenin蛋白的升高且差异有统计学意义（t＝7.033，P＜0.01）。见图4。

图4 Western blot检测Wnt和β-catenin蛋白表达

3 讨论

近年来，临床关于幼年儿童颅骨缺损是否修补仍存在争议，在广泛缺血性脑卒中、重型颅脑损伤（TBI）和颅内出血（ICH）患者均行减压开颅术，以治疗或避免顽固性颅内高压的严重后果。去骨瓣减压手术能有效地缓解和降低颅内压，能及时地防止脑疝等急重症的发生。临床研究表明，对于重度的颅脑损伤的病人，及时行去骨瓣减压术能有效地促进患者神经功能的恢复，且术后并发症也相对较少。

研究表明，非编码RNA在骨组织、软骨组织的生长调节中扮演了很重要的角色。有研究表明LncRNA ODSM的靶向过表达可在体内和体外调节成骨细胞功能。同时，Liu et al发现沉默 LncRNA MEG3可调节Wnt／β-catenin信号通路来治愈胫骨损伤。在与骨疾病相关的代谢中GAS8-AS1可能通过下调致癌LncRNA UCA1抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭。而H19通过与之竞争的miRNA调控STAT2，在ADSCs软骨分化过程中发挥其调节作用。MicroRNA-139-3p通过靶向 ELK1并与 LncRNA ODSM相互作用来调节成骨细胞的分化和凋亡，同时 MicroRNA-19b-3p通过与 LncRNA H19相互作用促进BMSCs的细胞增殖和成骨分化。本研究表明在幼羊颅骨缺损区域新生的骨组织中检测到95个基因的上调及76个基因的下调，通过对骨组织进行PCR的验证显示，与原生的骨组织相比，新生骨内LncRNA ODSM、UCA1表达上调，H19、MEG3的表达下调，表明在新生的骨组织中LncRNA的变化参与了新生骨的调节。

Wnt蛋白会通过旁分泌与自分泌的方式与细胞膜上的卷曲蛋白受体（FZD）和低密度脂蛋白受体（LRPs）相结合并激活下游散乱蛋白（Dsh）解除下游糖原合成酶激酶-3β、轴抑制蛋白1，抑制β-catenin降解使其在胞质中不断积累，浓度的升高加速β-catenin入核，激活相关靶基因，并发挥相应的生物学效应。该通路主要在细胞的增殖、分化、迁移以及凋亡中发挥作用。骨特异性碱性磷酸酶（bone specific alkaline phosphatase，BALP）、OCN作为骨形成的标志物在骨的生长过程中扮演了很重要的角色，BALP是成骨细胞的一种细胞外酶，其主要作用是在成骨过程中水解磷酸酶，为羟基磷灰石的沉积提供磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，有利于成骨。临床研究表明，ALP的水平与成骨细胞呈线性关系，且对于ALP的检测已经成为临床上检测成骨细胞活跃的标志。有研究显示在成骨细胞 MC3T3-E1中，PS-GOS通过调节 Wnt／β-catenin信号通路上调了 BMP-2和Runx2的mRNA和蛋白表达水平，并伴有ALP和OCN活性的增加。与先前的研究一致，该研究显示建立颅骨缺损模型3个月后，与原生骨组织相比，新生骨组织 Wnt、β-catenin蛋白的表达升高，ALP及OCN的表达也升高，数据表明Wnt／β信号通路蛋白表达的增加能促进ALP、OCN的上调而修复缺损部位骨组织的生长。

测序及PCR实验表明，与原生骨组织组相比，幼羊颅骨缺损部位LncRNA表达量存在差异，上调的及下调的LncRNA可能通过调控骨生长代谢过程中经典的Wnt／β信号通路而起作用，4种LncRNA可作为调节骨代谢、骨生长的新靶点，其具体的调控通路及所涉及的机制仍有待研究。该研究以幼年小尾寒羊为研究对象，此大动物模型接近幼年儿童颅骨损伤修复过程，其中涉及的基因与幼年儿童颅骨损伤修复过程中的基因更接近。该研究可为指导临床幼儿颅骨损伤的外科修补治疗提供实验依据。