右美托咪定减轻脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的作用

秦智刚，徐尤年，李 锟

脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）常见于心肺复苏、脑外伤等脑缺血低氧后的再灌注过程，临床尚无有效的治疗手段。研究显示，CIRI的发生可能与机体过量的氧自由基、炎症反应、细胞凋亡等有关。转录因子E2相关因子 2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）／抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路是机体内最重要的抗氧化应激系统，可以抵抗内外界的氧化应激，应对各种外来损伤。研究显示，Nrf2／ARE信号通路在 CIRI的发生发展中具有重要作用，可以清除机体过多的氧自由基，保护脑组织损伤。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一种临床常用的镇静剂，近年来研究显示Dex可以减少炎性因子的释放，减轻脑组织炎性损伤，但其对CIRI的氧化应激损伤尚不清楚。该研究分析了Dex对CIRI大鼠Nrf2／ARE信号通路的影响，旨在为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与动物

多功能酶标检测仪（iMark680）购自美国Bio-Rad公司；Dex注射液（国药准字H20183219）购自江苏扬子江药业集团有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；标记二抗的辣根过氧化物酶，购于丹麦DAKO公司；RT-PCR试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关 X蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、Nrf2、血红素加氧酶（hemeoxygenase-1，HO-1）、醌氧化还原酶 1（quinone oxidoreductase 1，NQO-1）单克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司；SPF级SD雄性大鼠30只，6～8周龄，体质量均为（240±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005]，饲养于北大医疗株洲恺德医院动物中心实验室，自由摄食与饮水。

1.2 动物造模及给药

将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和Dex组各10只。模型组和Dex组大鼠采用Longa法制备大鼠CIRI模型，常规麻醉，采用MCAO栓线结扎脑中动脉，缺血120 min后拔出栓线实现脑组织的再灌注；假手术组仅插入栓线，不结扎。Dex组于再灌注后即刻腹腔注射100 μg／kg Dex（浓度为 10 mg／L）；模型组和假手术组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。

1.3 各组大鼠神经体征缺失评分和脑梗死体积分数

再灌注24 h后，参照Zea Longa 5分制标准进行神经体征缺失评分。处死大鼠，取大鼠缺血区脑组织，氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色法计算脑梗死体积分数。

1．4 各组大鼠脑组织损伤检测

取甲醛固定的大鼠脑缺血区组织，制作切片，分别进行HE染色和TUNEL染色，显微镜下观察组织的病理变化和阳性细胞数，计算细胞凋亡率；严格按照试剂盒说明操作染色。

1．5 脑组织中SOD、MDA和NO测定

取新鲜的大鼠脑缺血区组织，严格按照试剂盒说明，采用ELISA法测定脑组织中SOD、MDA、NO水平。

1．6 RT-PCR检测脑组织 Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA的表达

取新鲜的大鼠脑缺血组织匀浆，按照试剂盒操作提取总RNA，经反转录合成cDNA，参考已有研究进行RT-PCR反应。

1．7 Westernblot检测脑组织 Nrf2、HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax和cleavedcaspase-3的表达

取新鲜的大鼠脑缺血组织，匀浆，提取总蛋白，进行SDSPAGE凝胶电泳、转膜、封闭，加一抗（Nrf2、HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax和 cleaved caspase-3，稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜，加二抗室温孵育2 h，显影，以β-actin为内参，凝胶成像分析系统对比条带强弱。

2 结果

2．1 CIRI大鼠的神经功能缺失评分和脑组织梗死体积分数

与模型组相比，Dex组大鼠神经功能缺失评分和脑梗死体积分数降低（P＜0.05），见表1。

表1 大鼠的神经功能缺失评分和脑组织梗死面积（±s，n＝10）

2．2 CIRI大鼠脑组织损伤

假手术组大鼠脑组织细胞结构完整，未见明显异常；模型组大鼠脑组织缺血区皮质出现水肿，胞间隙变宽，细胞核固缩深染，出现变性和坏死区；Dex组大鼠脑缺血区皮质病理损伤减轻。见图1。

图1 大鼠脑组织病理损伤 HE ×200

2．3 CIRI大鼠脑组织细胞凋亡

与假手术组相比，模型组和Dex组大鼠脑组织细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组相比，Dex组脑组织细胞凋亡率下降（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组和Dex组大鼠脑组织 cleaved caspase-3／Bcl-2、Bax／Bcl-2的表达上调（P＜0.05）；与模型组相比，Dex组大鼠脑组织 cleaved caspase-3／Bcl-2、Bax／Bcl-2的表达下调（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 脑组织细胞凋亡及相关蛋白的表达 ×200

表2 脑组织细胞凋亡及相关蛋白的表达（±s，n＝10）

2．4 CIRI大鼠脑组织SOD和MDA水平

与假手术组相比，模型组和Dex组大鼠脑组织SOD活性下降（P＜0.05），MDA和NO水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，Dex组大鼠脑组织SOD活性升高（P＜0.05），MDA和 NO水平下降（P＜0.05），见表3。

表3 脑组织SOD和MDA水平（±s，n＝10）

2．5 CIRI大鼠脑组织 Nrf2、HO-1、NQO-1mRNA表达

与假手术组相比，模型组和Dex组大鼠脑组织Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA的表达上调（P＜0.05）；与模型组相比，Dex组大鼠脑组织Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA的表达上调（P＜0.05），见表4。

表4 脑组织 Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA表达（±s，n＝10）

2．6 CIRI大鼠脑组织 Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达

与假手术组相比，模型组和Dex组大鼠脑组织Nrf2、HO-1和 NQO-1蛋白的表达上调（P＜0.05）；与模型组相比，Dex组大鼠脑组织 Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白的表达上调（P＜0.05），见图3、表5。

图3 Western blot法检测脑组织Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白

表5 脑组织Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达（±s，n＝10）

3 讨论

脑缺血一定时间后再灌注时，大量的氧自由基一方面可引起细胞膜脂质过氧化、能量代谢障碍等导致神经细胞坏死，另一方面也可激活凋亡相关的信号通路，诱导神经细胞凋亡。Dex是一种镇静剂，近年来研究显示，Dex还可以激活神经系统及其他脏器的α2受体或咪唑啉受体，保护神经、心脏、肾脏、肺等的功能。本研究中，Dex后处理可以显著改善CIRI的大鼠的神经功能和脑组织损伤，缩小其脑梗死面积。龚辉等的研究显示，Dex可以减轻CIRI大鼠的炎症反应，抑制神经元细胞凋亡，保护CIRI大鼠的脑组织损伤，改善其神经功能，与本研究结果基本一致，提示Dex后处理可以改善CIRI大鼠的脑组织损伤和功能障碍，有望应用于临床治疗。

Nrf2／ARE信号通路是机体内最重要的内源性抗氧化信号通路，在正常的生理状况下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1在细胞浆中相偶联，处于被抑制状态，一旦细胞受到氧自由基刺激时，前者可与后者发生解偶联，转位至细胞核，启动ARE调控的靶基因的表达。ARE是一个DNA-启动子结合序列，当活化的Nrf2转位至细胞核与其结合后，可激活下游多个抗氧化基因HO-1、NQO-1、谷胱甘肽-S转移酶等的表达，清除机体过多的氧自由基。本研究中，Dex后处理可以显著上调Nrf2、HO-1和NQO-1的表达。HO-1和NQO-1具有抗氧化、抗细胞凋亡、抗炎和维持微循环的功能，在机体抗氧化应激中具有重要作用，提示Dex后处理可能通过激活Nrf2／ARE信号通路，发挥其抗氧化作用。本研究中，Dex后处理还可以显著升高SOD活性，降低脑组织MDA和NO水平，提示Dex后处理可能通过激活Nrf2／ARE信号通路，激活下游抗氧化基因HO-1和NQO-1的表达，清除机体过多的氧自由基，保护脑组织细胞免于损伤。

本研究中，Dex后处理可以显著减少CIRI大鼠脑组织细胞的凋亡率，下调 Bax／Bcl-2和 cleaved caspase-3／Bcl-2的表达。临床研究显示，细胞凋亡在CIRI损伤中具有重要作用，是脑组织神经细胞死亡的主要原因。Bcl-2／Bax蛋白是一组调节线粒体凋亡途径的重要蛋白，在凋亡信号刺激下，Bax可与Bcl-2结合，破坏线粒体膜结构，导致细胞色素C释放，激活 caspase反应，诱导细胞凋亡。兰琛的研究显示，Dex干预可以上调凋亡基因Bcl-2的表达，抑制Bax基因转膜，抑制细胞色素C的释放，抑制caspase相关的凋亡级联反应，从而抑制脑组织细胞的凋亡，保护脑组织免于损伤，与本研究结果基本一致，提示Dex后处理可能通过清除机体过多的氧自由基，抑制脑组织细胞的凋亡，改善脑组织损伤。

综上所述，Dex后处理可以促进HO-1和NQO-1的表达，清除机体过多的氧自由基，抑制脑组织细胞凋亡，改善CIRI大鼠脑组织细胞损伤和神经功能障碍，其作用机制可能与Nrf2／ARE信号通路的激活有关。但该研究仅初步探讨了Dex后处理可能的机制，其具体的作用机制尚需进一步研究。