法舒地尔修饰的巨噬细胞治疗实验性变态反应性脑脊髓炎的分子机制

刘金泉，张继红，刘春云

多发性硬化是中枢神经系统常见的自身免疫性疾病类型之一，其主要的病理表现为脱髓鞘轴突损伤以及炎症反应，是导致人类残疾的主要神经疾病之一。目前多发性硬化的治疗，药物，多为激素类药物，只能暂时性缓解病症，而且长期使用此类药物副作用明显，因此寻求效果好、毒副作用小的药物成为临床研究的重点。随着细胞治疗的不断开展，动物实验表明间充质干细胞对实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）具有治疗作用，可抑制炎性因子的表达和减少变态反应性脑脊髓炎对脊髓的损伤。法舒地尔是Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho associated coiled coil forming protein kinase 1，ROCK1）选择性抑制剂，对EAE小鼠具有良好的治疗效果，可缓解 EAE小鼠的临床症状。近年的研究显示法舒地尔修饰来源于EAE小鼠的脾脏单个核细胞建立被动EAE模型则无法导致EAE发生，这为EAE的临床治疗提供了很好的治疗方案。该研究在体外采用法舒地尔修饰来源于EAE小鼠的腹腔巨噬细胞，分析其对EAE小鼠的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

雌性 8周龄（20 g）C57BL／6小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2017-0006，动物合格证号：0001507。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）多肽由西安联美生物科技有限公司合成；完全弗氏佐剂和注射破伤风毒素购自美国Sigma公司；结核杆菌购自美国BD公司；白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）ELISA试剂盒购自美国R＆D公司；FITC抗小鼠F4／80、PE抗小鼠CD206、PE抗小鼠CD16／32流式抗体购自美国Ebioscience公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰酶以及青链霉素均购自美国Gibcon生物有限公司；逆转录试剂盒和qPCR SYBR Green Master Mix购自南京诺唯赞生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 EAE模型构建 40只雌性C57BL／6小鼠在SPF级环境中适应1周。将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽和结核杆菌混合物与等体积的完全弗氏佐剂混匀，采用注射器反复抽推将组成制备成白色悬浊液，以静置不分层为最佳。将40只小鼠采用乙醚麻醉，将抗原乳液在小鼠脊柱两侧注射4个点，每点注射100μl，以注射当天作为注射免疫0 d。并于小鼠免疫当天和免疫后48 h经腹腔注射百日咳毒素（500 ng／只）进行加强免疫。

1.2.2 腹腔巨噬细胞的分离和处理 雌性C57BL／6小鼠无菌条件下腹腔注射磷酸盐缓冲液5 ml，按摩腹腔30 min，然后将细胞悬液从腹腔吸出，1 500 r／min离心 5 min，洗涤后加入 PRIM 1640培养基，贴壁2 h后，除去未贴壁的细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。将细胞分为两份（来源于同一只供体小鼠），一份采用PBS处理，一份采用20μg／ml法舒地尔处理，置37℃、5% CO常规培养72 h，用于后续回输使用。PBS处理的巨噬细胞为对照组，法舒地尔处理的细胞为实验组。

1.2.3 巨噬细胞回输 将对照组和实验组细胞采用0.25%胰酶消化，然后将细胞密度调整为5×10个／ml，给于EAE模型小鼠尾静脉注射500μl，然后继续在SPF级动物房饲养。

1.2.4 临床症状评分 采用Kono评分标准进行临床症状评分。无症状为0分；尾巴无力为1分；尾巴麻痹且出现轻微后肢无力为2分；尾巴麻痹且后肢严重无力者为3分；尾巴麻痹且后肢也出现麻痹反应者为4分；死亡为5分。

1.2.5 荧光定量PCR分析 对照组和实验组小鼠提取巨噬细胞，然后采用RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用紫外分光光度计测定浓度。然后设计诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、精氨酸酶1（Arginase-1，Arg-1）、YM1、FIZZ和 GAPDH的 PCR引物，引物浓度稀释为10 pmol／L，结果如表1所示。按照下列体积制备PCR反应体系：2×SYBR Green Mix 10μl，F／R引物各 0.5μl，cDNA（1∶50）2 μl，双蒸水7μl，总体积20μl。根据上述体系配制所需要的体积，然后每孔20μl加到96孔荧光定量PCR板中，1 000 r／min离心2 min将液体完全甩至板子底部。然后在荧光定量PCR仪上设置以下参数：变性95℃，30 s；退火58℃、30 s，延伸 72℃、30 s，39个循环，然后制作熔解曲线。反应结束后直接从仪器上读取目的基因mRNA的相对表达水平。

1.2.6 ELISA分析细胞因子 对照组和实验组小鼠经腹腔提取巨噬细胞，培养24 h后，取细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒测定巨噬细胞分泌的IL-12和IL-10细胞因子的水平。

1.2.7 流式细胞检测 对照组和实验组腹腔巨噬细胞1×10采用0.25%胰酶消化，细胞用PBS洗涤1次，每组分为2份，将细胞重悬于100μl PBS，一份加入FITC抗小鼠F4／80和 PE抗小鼠CD206各5μl，另一份加入FITC抗小鼠F4／80和PE抗小鼠 CD16／32各 5μl，冰上避光孵育 1 h，然后采用PBS洗涤1次，然后重悬于300μl PBS溶液中，采用流式细胞术分析不同巨噬细胞亚群的比例。

2 结果

2.1 2组小鼠临床症状分析

40只小鼠建模成功率100%，未出现死亡。中枢神经HE染色结果如图1显示，对照组小鼠脊髓存在大量炎症细胞的浸润，而实验组小鼠骨髓中炎症细胞浸润较少。对照组和实验组小鼠临床评分和体质量分析显示，与对照组比较，实验组小鼠经尾静脉回输巨噬细胞后临床症状评分降低，体质量上升，差异有统计学意义（F＝6.135，P＜0.001；F＝3.105，P＝0.011）。见图2。

图1 对照组和实验组小鼠中枢神经系统病理性改变

表1 荧光定量PCR引物序列

图2 两组小鼠平均临床症状评分和体质量比较

2.2 法舒地尔对体外巨噬细胞的影响

法舒地尔体外处理小鼠腹腔巨噬细胞72 h后，采用荧光定量PCR分析M1和M2型巨噬细胞标志物，结果如表2所示，与未处理细胞比较，法舒地尔处理巨噬细胞后，M1型巨噬细胞标志物iNOS和IL-12 mRNA表达水平下调，而M2型巨噬细胞标志物Arg1和YM-1 mRNA表达水平上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 法舒地尔体外处理对巨噬细胞表型的影响（n＝20，±s）

2.3 2组小鼠巨噬细胞亚群比较

结果如图3所示，流式细胞术分析对照组和实验组小鼠腹腔巨噬细胞亚群的变化，对照组 F4／80CD16／32巨噬细胞比例（72.8±10.2）%高于实验组（8.0±2.9）%，差异有统计学意义（t＝12.105，P＜0.001）。而对照组小鼠腹腔F4／80CD206巨噬细胞比例（9.1±3.0）低于实验组（82.3±12.8），差异有统计学意义（t＝10.618，P＜0.001）。

图3 流式细胞术分析了对照组和实验组小鼠巨噬细胞亚群的变化

2.4 2组小鼠巨噬细胞表型分析

采用荧光定量PCR和ELISA分析了M1和M2型巨噬细胞标志物的表达情况，结果显示，与对照组比较，实验组小鼠腹腔巨噬细胞iNOSmRNA和IL-12细胞因子的表达水平下调，差异有统计学意义（t＝4.132，P＜0.001；t＝3.198，P＜0.001）。与对照组比较，实验组小鼠腹腔巨噬细胞 Arg-1、YM-1、FIZZ mRNA、IL-10细胞因子表达水平上调，差异均有统计学意义（t＝7.091，P＜0.001；t＝11.094，P＜0.001；t＝6.182，P＜0.001；t＝3.942，P＜0.001）。见图4。

图4 对照组和实验组小鼠腹腔M 1和M 2型巨噬细胞标志物表达水平

3 讨论

多发性硬化是由免疫细胞介导的中枢神经系统功能障碍，每次发作会造成身体的损伤，严重影响患者的身体健康和生活质量。EAE的免疫发病机制与多发性硬化的发病机制极为类似，均表现为中枢神经系统炎症的大量浸润和白质脱髓鞘并表现为多种神经功能障碍，由于两者的相似性，EAE模型是目前人类多发性硬化疾病的主要动物模型。目前对于EAE或者多发性硬化没有特效药，以EAE为模型的相关治疗研究有望为多发性硬化的治疗提供新的途径。细胞治疗采用生物工程方法获取和／或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的，是目前治疗多发性硬化的一种趋势。大量研究显示采用间充质干细胞对EAE小鼠具有治疗作用，其可抑制炎性因子的表达和减少脊髓变态反应性。

ROCK1信号途径是机体中重要的信号转导通路，其在多发性硬化和EAE发生过程中发挥着重要作用。目前研究显示采用ROCK1抑制剂法舒地尔可以治疗EAE，并减少炎症细胞浸润和脱髓鞘现象，机制研究显示法舒地尔可以改变T淋巴细胞、巨噬细胞的表型。研究表明修饰的脾脏单个核细胞可以抑制EAE被动模型的发生。这一结果提示体外修饰的免疫细胞可以在体内缓解EAE的症状。

巨噬细胞是一类功能多样的细胞亚群，其在不同的刺激下可发生表型的变化，进而发挥不同的生物学作用。巨噬细胞在脂多糖或者TH1型细胞因子干扰素-γ的作用下会向炎症性M1型巨噬细胞分化，从而放大免疫炎性反应，因此，炎性M1型巨噬细胞促进了EAE的发生和发展；但是其在TH2型细胞因子IL-4、IL-13和IL-10的刺激下，会向抗炎性M2型巨噬细胞转化，并释放炎症抑制因子IL-10进一步抑制机体免疫反应，达到缓解炎症反应的目的。研究表明M2型巨噬细胞可改善EAE小鼠免疫微环境，减少神经元变性和脱髓鞘，起到保护机体的作用。

本研究将腹腔巨噬细胞与法舒地尔在体外进行共培养，将共培养细胞经尾静脉回输给EAE模型小鼠，分析了法舒地尔修饰的巨噬细胞对EAE模型的治疗作用。研究结果显示，采用法舒地尔修饰的巨噬细胞可以改善EAE小鼠的临床症状，同时可以抑制小鼠体质量的下降，说明体外法舒地尔修饰的巨噬细胞对EAE具有治疗作用。进一步分析显示，经法舒地尔修饰的巨噬细胞治疗后的EAE小鼠，其体内M2型巨噬细胞的比例提高，而M1型巨噬细胞的比例下调，说明法舒地尔修饰的巨噬细胞进入小鼠体内改善了EAE小鼠体内的免疫环境。M2型巨噬细胞可以分泌IL-10，而IL-10是主要的免疫抑制细胞因子，其不仅作用于巨噬细胞，使机体炎性M1型巨噬细胞亚群降低，而且可以诱导TH0细胞向TH2型细胞分化，进而使机体免疫偏向于抗炎状态，对改善EAE具有重要的意义。

综上所述，给EAE小鼠回输抗炎性T淋巴细胞或者给予抗炎性的细胞因子则可改善EAE小鼠免疫微环境，达到治疗EAE的目的。