m iR-122-5p靶向ADAM 10调控Notch信号通路对人卵巢癌细胞SKOV-3的上皮-间质转化的抑制作用

李根林，刘 杰，谢 晶，余芙蓉，胡 意

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）使肿瘤细胞失去上皮特性，获得间质特性，促进肿瘤细胞侵袭和转移。研究表明EMT与卵巢肿瘤的转移有关。去整合素金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）是细胞膜相关蛋白，能触发配体-受体结合而激活Notch信号通路，调节细胞迁移。但 ADAM10是否通过Notch信号通路参与卵巢癌细胞的迁移尚不清楚。microRNA（miRNA）是一种非编码的小RNA，调控靶向信使 RNA（mRNA）。miR-122-5p在卵巢癌患者外泌体中异常低表达，但miR-122-5p对人卵巢癌EMT的作用尚未明确。该研究通过共转染miR-122-5p过表达和ADAM10过表达载体，探讨miR-122-5p与ADAM10的靶向关系以及Notch信号通路在人卵巢癌细胞EMT的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器

人卵巢癌细胞SKOV-3及McCoy′s 5a培养基购自美国ATCC公司；胎牛血清和完全培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自武汉纯度生物科技有限公司；转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司。TRIzol试剂购自上海晶抗生物工程有限公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒和蛋白裂解液购自上海生工；Matrigel购自美国BD公司；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；ADAM10野生型（Wt）和突变型（Mut）荧光素酶质粒载体pcDNA-ADAM10（pc-ADAM10）、miR-122-5p mimic及其阴性对照mimicNC均由上海吉玛制药技术有限公司合成；兔抗人ADAM10抗体购自美国Novus Biological公司；兔抗人Notch1抗体、兔抗人HES家族bHLH转录因子1（hairy and enhancer of splithomolog-1，HES1）抗体、兔抗人 Hairy相关转录因子1（hariy and enhancer of split related with YRPW motif-1，HEY1）抗体、兔抗人Snai1抗体、兔抗人E-cadherin抗体、兔抗人N-cadherin抗体和GAPDH购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。实时荧光定量仪（7500）购自美国应用生物系统公司；垂直电泳槽、电泳仪购自美国Bio-Red公司；低温离心机购自德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 用含有10%胎牛血清的McCoy′s5a培养基在37℃含5% CO的恒温培养箱中进行培养，待人卵巢癌细胞SKOV-3生长到对数期后，用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液冲洗细胞。再加入5 ml完全培养基在37℃含5% CO的恒温培养箱中常规培养。将1×10个／ml SKOV-3细胞接种在6孔板中培养24 h，再根据转染试剂盒说明书，利用 Lipofectamine 3000将 miR-122-5p mimic和pc-ADAM10分别或同时转染至SKOV-3细胞中。将SKOV-3细胞分为5组：①空白对照组（Blank组）：不进行任何处理的SKOV-3；②阴性对照组（mimic NC组）：转染了 mimic NC的 SKOV-3细胞；③过表达组（miR-122-5p mimic组）：转染了miR-122-5p mimic的SKOV-3细胞；④ADAM10过表达组（pc-ADAM10组）：转染了 pc-ADAM10的 SKOV-3细胞；⑤共转染组（miR-122-5p mimic＋pc-ADAM10组）：同时转染了miR-122-5p mimic和pc-ADAM10的SKOV-3细胞。每组做3个复孔。

1.2.2 qRT-PCR法检测miR-122-5p和ADAM10的mRNA相对表达量 用TRIizol法提取转染miR-122-5p mimic的3组细胞总RNA，然后按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，并用荧光定量PCR方法以cDNA为模板进行定量扩增。所用PCR引物序列：miR-122-5p上游引物为 5′-GGGGTGGAGTGTGACAATG-3′，下游引物为 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；ADAM10上 游 引 物 为 5′-AAGAAGCTTCCCACAAGGCA-3′，下游引物为 5′-TGTGTACGCAGAGTATCTAACTGG-3′；GAPDH上游引物为 5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′，下游引物为5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′，下 游 引 物 为 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应程序：95℃预变性5 min，然后95℃变性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸50 s，35个循环后，72℃终延伸10 min。得到结果 Ct值，再采用 2法计算 miR-122-5p和ADAM10的mRNA的表达量。将Blank组的mRNA表达量设为1，其他组的与Blank组的mRNA表达量比值为该组mRNA的相对表达量。

1.2.3 双荧光素酶报告基因实验检测miR-122-5p与ADAM10的相互作用关系 用 Targetscan（http：／／www.targetscan.org）之间存在的碱基互补配对关系。将人卵巢癌细胞SKOV-3以1×10个／孔接种在96孔板上，当孔内细胞达到60%的密度后，用试剂 Lipofectamine 3000将 miR-122-5p mimic、mimic NC分别与 ADAM10-Wt、ADAM10-Mut荧光素酶质粒共转染至SKOV-3细胞中。转染48 h后用双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。相对荧光素酶活性用萤火虫与肾素荧光素酶活性之比表示。

1.2.4 Transwell法检测细胞的迁移和侵袭情况取共转染四组对数生长期SKOV-3细胞，将细胞悬液调整为2×10个／ml接种到Transwell上室，将含10%胎牛血清的培养基加入Transwell下室后在37℃培养箱中培养24 h。再用0.1%结晶紫染色30 min，最后将Transwell小孔倒置在显微镜下，在200倍视野中，将膜分为上下左右中五部分，分别计算细胞数量后做平均数，即为迁移的细胞数量。提前准备Matrigel，用预冷的无血清培养基将Matrigel稀释成1 mg／ml浓度，再将100μl的Matrigel加入Transwell上室底部中央，然后在37℃培养箱中温育5 h成胶状。再取对数生长期SKOV-3细胞，步骤与迁移一致，最后在200倍视野的显微镜下，采用同样的方法观察侵袭的细胞数量。

1.2.5 Western blot法检测ADAM10蛋白、Notch通路蛋白和EMT蛋白表达水平 用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解共转染的四组SKOV-3细胞。12 000 r／min离心5 min后收集上清液，在水浴中加热使蛋白质变性。用BCA法定量蛋白质后，用SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转移到硝酸纤维素膜（PVDF）。然后，用脱脂奶粉室温封闭膜30 min，再加入一抗 ADAM10、Notch1、HES1、HEY1、Snail、E-cadherin、N-cadherin在4℃下孵育过夜，用Tris-HCl缓冲盐＋Tween 20（TBST）溶液冲洗PVDF膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。加入化学发光液，待出现条袋后终止反应。GAPDH用作内参照物，目的条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2．1 miR-122-5p对人卵巢癌细胞SKOV-3中ADAM10的表达水平的影响

miR-122-5p mimic转染到SKOV-3细胞后，与Blank组和mimic NC组比较，miR-122-5p mimic组细胞中miR-122-5p表达水平升高（F＝98.17，P＜0.01，图 1A），而 ADAM10 mRNA（图1B）和蛋白（图 1C）表达水平均降低（F＝100.6，P＜0.01；F＝50.38，P＜0.01），这说明 miR-122-5p与ADAM10之间可能存在靶向调控关系。

图1 m iR-122-5p m im ic转染SKOV-3细胞后m iR-122-5p和ADAM 10的表达水平

2．2 miR-122-5p与ADAM10的靶向关系

生物信息学分析表明，miR-122-5p与ADAM10的3′-UTR区具有靶向结合位点（图2A）。在ADAM10-Wt的人卵巢癌细胞 SKOV-3中，与 mimic NC组比较，miR-122-5p mimic组相对荧光素酶活性降低（t＝11.73，P＜0.01，图2B）。此结果表明在人卵巢癌细胞SKOV-3中，miR-122-5p能与ADAM10 mRNA靶向结合。

图2 双荧光素酶分析系统验证m iR-122-5p和ADAM 10 m RNA的靶向关系

2．3 过表达miR-122-5p对SKOV-3细胞迁移能力的影响

与 Blank组（135.33±25.34）相比，miR-122-5p mimic组SKOV-3细胞发生迁移的细胞数目（37.33±12.54）降低（t＝6.004，P＜0.05），而 pc-ADAM10组发生迁移的细胞数目（458.00±34.05）升高（t＝13.181，P＜0.001）。与 pc-ADAM10组相比，miR-122-5p mimic＋pc-ADAM10组发生迁移的细胞数目（195.67±26.10）降低（t＝10.633，P＜0.01）。结果表明过表达miR-122-5p能抑制 ADAM10过表达诱导SKOV-3细胞迁移的作用。见图3。

图3 Transwell检测SKOV-3细胞的迁移能力变化

2．4 过表达miR-122-5p对SKOV-3细胞侵袭能力的影响

与 Blank组（157.00±22.60）相比，miR-122-5p mimic组SKOV-3细胞穿过基底膜发生侵袭的细胞数目（44.00±14.58）降低（t＝7.289，P＜0.01），而pc-ADAM10组穿过基底膜发生侵袭的细胞数目（428.67±43.44）升高（t＝11.504，P＜0.01）。与pc-ADAM10组比较，miR-122-5pmimic＋pc-ADAM10组穿过基底膜发生侵袭的细胞数目（232.67±26.52）降低（t＝8.515，P＜0.01）。以上结果表明过表达miR-122-5p具有抑制高表达ADAM10诱导SKOV-3细胞侵袭的作用。见图4。

图4 Transwell检测SKOV-3细胞的侵袭能力变化

2．5 过表达miR-122-5p对Notch通路及EMT相关蛋白表达的影响

与Blank组相比，miR-122-5p mimic组 SKOV-3细胞中 Notch通路相关蛋白Notch1蛋白及其下游蛋白HES1和HEY1表达水平降低（P＜0.01）；EMT相关蛋白Snail和N-cadheirn蛋白表达水平降低而E-cadherin蛋白表达水平升高（P＜0.05）；pc-ADAM10组SKOV-3细胞中 Notch1、HES1、HEY1、Snai1、N-cadherin蛋白表达水平上升（P＜0.01）；E-cadherin蛋白表达水平下降（P＜0.01）。在 pc-ADAM10组细胞共转染 miR-122-5p mimic后，Notch通路相关蛋白表达水平降低（P＜0.05），Snail、N-cadherin蛋白表达水平下降而E-cadherin蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见图5。

图5 Western blot检测SKOV-3细胞Notch通路和EM T相关蛋白的表达水平

3 讨论

卵巢癌是一种以转移为特征的恶性肿瘤，恶性程度高。目前，越来越多的证据表明EMT在肿瘤转移中具有重要作用。在作用机制方面，miRNA通过与靶基因的3′非翻译区（3′-UTR）结合，在转录后水平上负调控靶基因的表达水平。在作用功能方面，miRNAs能调节不同类型癌细胞的EMT。有研究表明，miR-448通过直接靶向乳腺癌细胞E-cadherin抑制因子Zeb1／2进而抑制癌细胞EMT过程。胃癌中miR-122-5p能通过靶向双特异性磷酸酶4抑制胃癌的发展。这些数据表明miR-122-5p在人类癌症中具有多个靶点。还有研究表明，miR-122-5p高表达能抑制胶质瘤的EMT。本研究结果表明，miR-122-5p通过靶向下调ADAM10表达抑制人卵巢癌细胞SKOV-3细胞的迁移侵袭以及EMT。

miRNAs具有抑癌和促癌功能，且与肿瘤转移有关。已有研究表明，miR-122-5p能结合 lncRNA进而抑制肝癌细胞的迁移、侵袭及 EMT。miR-122-5p能通过调节特异性核基质结合区结合蛋白1（STAB1）的表达抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。本研究结果表明，miR-122-5p通过靶向 ADAM10抑制人卵巢癌细胞SKOV-3的迁移、侵袭以及EMT，然而过表达ADAM10能逆转miR-122-5p对人卵巢癌细胞SKOV-3迁移与侵袭的抑制作用。提示miR-122-5p在人卵巢癌中可能作为一种抑癌因子，并通过靶向下调ADAM10表达而发挥抑癌作用。

ADAM是一类含去整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白质，它们在各种重要的生物细胞过程中的细胞-细胞、细胞-基质的相互作用中起着关键作用。Notch信号通路中α-分泌酶的作用主要涉及ADAM10和ADAM17。ADAM10是一种锌依赖的跨膜蛋白酶，能调节Notch、EGF、E-cadherin蛋白和其他信号通路。以往研究表明肾小管上皮细胞中ADAM10的过度表达增加了E-cadherin的表达水平，减少了细胞间的黏附，促进了上皮细胞的迁移能力。ADAM10还能促进非小细胞肺癌细胞的EMT。本研究结果显示ADAM10能促进人卵巢癌细胞SKOV-3的迁移侵袭以及EMT。对Notch信号通路的研究表明Notch信号通路参与EMT相关转录因子的激活。miR-449a通过与mRNA的3′-UTR结合抑制Notch途径调节EMT，抑制肝癌细胞的迁移侵袭能力。阻断Notch1信号通路能有效抑制胃癌的转移。但有研究表明 Notch2的缺失能激活TRAF6／Akt轴并促进鼻咽癌的转移。这些研究结果说明Notch信号通路对肿瘤EMT的作用具有两面性（促进和抑制）。本研究结果表明miR-122-5p通过降低Notch信号通路活性进而抑制人卵巢癌的EMT过程。ADAM10通过激活Notch信号途径进而增强人卵巢癌 EMT。miR-122-5p具有减轻 ADAM10通过激活Notch信号途径促进人卵巢癌EMT的作用。