外源性Apelin-13通过调控VEGF／PI3K／Akt信号通路促进大鼠股骨骨折愈合

曾昭池，汤 勇，张先慧，朱志勇，吴开元，袁永端

骨折是最常见的外科损伤，促进骨再生、骨质生成和钙化在骨缺损修复中十分重要。Apelin是血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白（APJ）的内源性配体，可介导血管生成和血管形成，Apelin-13是其中研究最为广泛的一类 Apelin。有研究表明，Apelin-13可参与调节糖尿病、肥胖、高血压、心血管等疾病的病理生理过程，但目前有关Apelin-13促进骨折愈合的研究鲜有报道。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为一种重要的血管生成因子，具有促进内皮细胞增殖、促进血管生成等重要的生物学功能。众多研究表明，VEGF可调控PI3K／Akt信号通路的激活，由此推测Apelin-13可能通过VEGF／PI3K／Akt信号通路诱导血管新生从而促进骨折愈合。该研究拟通过构建股骨骨折大鼠模型，探讨Apelin-13对骨折愈合的影响及可能作用机制，为临床上骨折的愈合研究提供新的方向和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级6～7周龄雄性SD大鼠40只，体质量（240±20）g，由湖南嘉泰实验动物有限公司提供，动物生产许可证编号：SCXK（湘）2019-0003。饲养条件为SPF级环境，温度为（23±2）℃，湿度为50% ～60%，12 h／12 h明暗交替，自由饮水、进食。

1.2 主要试剂与仪器

Apelin-13（批号：SC-351718，规格：1 mg）购自美国 Santa Cruz公司；大鼠骨源性碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（amino terminalpropeptide of typeⅠ procollagen，PINP）、Ⅰ型胶原C端肽（C-terminal telopeptides of typeⅠ collagen，CTX）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b）ELISA试剂盒购于美国 R＆D公司；VEGFA、VEGFR2、PI3K p85、Akt、p-Akt（Ser473）和 β-actin抗体购于美国 Cell Signaling Technology公司；BCA试剂盒、苏木精、伊红购于上海碧云天生物公司；TRIzol、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；FC全自动酶标仪购于美国Thermo公司；SYSTEM GelDoc XR＋凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 动物造模及分组处理 40只雄性SD大鼠，适应性饲养1周后，随机分成4组：假手术组（sham组）、模型组（Model组）、Apelin-13低剂量组（Apelin-13 L组）、和 Apelin-13高剂量组（Apelin-13 H组），每组10只。除sham组外，其他各组大鼠均参照文献构建大鼠股骨骨折模型。腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠局部脱毛，肢备皮消毒，取髌骨内侧及股外侧切口，置入直径1 mm克氏针，骨折钳将股骨干中段剪断，反复冲洗后逐层缝合切口归笼。sham组大鼠不剪断股骨，其他操作一致。术后立即进行X射线拍摄，观察到大鼠右股骨骨折，对位良好，髓内针固定在位，确认造模成功。造模成功后即进行药物干预，Apelin-13 L组和Apelin-13 H组大鼠分别腹腔注射25μg／（kg·d）和75 μg／（kg·d）的 Apelin-13，而 sham组和 Model组大鼠分别注射等量0.9%氯化钠溶液，连续4周。

1.3.2 Micro CT测定骨显微参数 药物干预结束后处死大鼠，剥离股骨收集全长股骨。通过Micro CT扫描检测各组大鼠股骨显微结构参数，包括骨密度、组织矿物质密度、骨体积分数（BV／TV）。

1.3.3 X射线观察骨愈合情况 收集各组大鼠的全长股骨进行X线检测，测量正、侧位片上骨痂最大直径大小，采用两者的平均值为骨痂的最大直径（callus diameter）。采用 Lane-Sandhu X线评分标准进行骨折愈合评分，摄片结果采用双盲法由两位影像科医生进行评分，取平均值，比较两组骨折愈合的差异。

1.3.4 苏木精 -伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察 取各组大鼠侧股骨，去除股骨周围肌肉等软组织，保留完整骨痂，置于10%中性甲醛固定48 h，使用乙二胺四乙酸脱钙液开始4周的脱钙过程，完成脱钙后进行石蜡包埋并行HE染色，于显微镜下观察病理改变，依据Huo-associates评分标准对各组骨痂形态进行评分。

1.3.5 ELISA检测血清骨转换标记物含量 取各组大鼠血清，按照试剂盒说明书采用ELISA法检测血清成骨标志物BALP、PINP和破骨标志物TRACP-5b、CTX表达水平。

1.3.6 qRT-PCR检测 收集各组大鼠骨痂组织，按照TRIzol试剂说明书提取骨痂样本总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，根据反转录试剂盒说明将提取得RNA反转录成cDNA后进行qRT-PCR检测。引物序列：VEGFA，（F）5′-ACTGGACCCTGGCTTTACTG-3′，（R）5′-GCTTTCTGCTCCCCTTCTGT-3′；β-actin，（F）5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′，（R）5′-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3′。反应条件：95℃预变性 10 min，95℃、10 s，55℃、20 s，40个循环。熔解曲线：95℃、1 min，55℃、1 min，95℃、10 s，以 β-actin为内参，采用 2法计算 VEGFA相对表达量。

1.3.7 Western blot检测 收集各组大鼠骨痂组织置于组织匀浆器内，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂于冰上研磨匀浆，12 000 r／min，4℃离心20 min，取上清液，采用BCA法测蛋白含量，上样到12%SDS-PAGE凝胶电泳中分离蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗VEGFA、VEGFR2、PI3K p85、Akt、p-Akt和 β-actin抗体，4℃过夜孵育，次日用洗膜缓冲液洗涤3次，加标记辣根过氧化物酶的二抗室温孵育1 h，滴加ECL试剂，在全自动凝胶成像系统中曝光显影，并用Image J软件统计灰度值，计算相对表达量。

2 结果

2．1 Apelin-13对大鼠股骨显微结构参数的影响

与sham组比较，Model组大鼠股骨的骨密度、组织矿物质密度和骨体积分数均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与 Model组比较，Apelin-13 H组大鼠的骨密度、组织矿物质密度和骨体积分数均增加，差异有统计学意义（P＜0.01），而Apelin-13 L组差异无统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠股骨显微结构参数比较（±s，n＝10）

2．2 Apelin-13对大鼠股骨愈合情况的影响

与sham组比较，Model组大鼠股骨X射线评分降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与Model组比较，Apelin-13 H组大鼠股骨X射线评分和骨痂直径增加，差异有统计学意义（P＜0.01），而 Apelin-13 L组差异无统计学意义。见表2。

表2 各组大鼠骨痂直径和X射线评分比较（±s，n＝10）

2．3 Apelin-13对大鼠股骨组织病理学的影响

sham组软骨组织完整，轮廓清晰；Model组和Apelin-13 L组新生骨小梁松质骨较稀疏，排列比较紊乱，可见大量软骨细胞浸润生长；Apelin-13 H组新生骨小梁结构较多，排列致密有序，可见较成熟的骨组织，骨痂逐渐吸收。见图1A。与sham组比较，Model组Huo-associates评分降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与 Model组比较，Apelin-13 H组Huo-associates评分增加，差异有统计学意义（P＜0.01），而Apelin-13 L组差异无统计学意义。见图1B。

图1 各组大鼠股骨组织切片病理观察

2．4 Apelin-13对大鼠血清中骨转换标记物含量的影响

与sham组比较，Model组大鼠血清中BALP、PINP水平降低，TRACP-5b、CTX含量增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与 Model组比较，Apelin-13 H组大鼠血清中BALP、PINP水平增加，TRACP-5b、CTX含量降低，差异有统计学意义（P＜0.01），而Apelin-13 L组差异无统计学意义。见表3。

2．5 Apelin-13对大鼠骨痂组织中VEGFA表达水平的影响

与sham组比较，Model组大鼠骨痂组织中VEGFA mRNA和蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与 Model组比较，Apelin-13 H组大鼠骨痂组织中VEGFA mRNA和蛋白表达水平上升，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）。而Apelin-13 L组与Model组比较，VEGFA mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义。见图2。

表3 各组大鼠血清中BALP、PINP、TRACP-5b和CTX含量比较（±s，n＝10）

图2 各组大鼠骨痂组织中VEGFA表达水平比较

2．6 Apelin-13对大鼠骨痂组织中 VEGF／PI3K／Akt信号通路蛋白表达的影响

与sham组比较，Model组大鼠骨痂组织中 VEGFR2、PI3K p85、p-Akt蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01），Akt蛋白表达水平差异无统计学意义；与Model组比较，Apelin-13 H组大鼠骨痂组织中 VEGFR2、PI3K p85和p-Akt蛋白表达水平增加，差异有统计学意义（P＜0.001），Akt蛋白表达水平差异无统计学意义。而Apelin-13 L组与Model组比较，以上蛋白表达水平差异无统计学意义。见图3。

图3 各组大鼠骨痂组织中VEGFR2、PI3K p85、Akt、p-Akt蛋白表达水平比较

3 讨论

局部血管生成对骨折愈合及其重要，而新生血管的形成过程主要依赖于血管内皮的增殖、迁移和毛细血管样管道的形成。有研究报道，Apelin具有促进血管生成、降低血压、调节水盐平衡及调节免疫等多种生物学效应，可将Apelin看作是一种新的血管形成因子，介导血管再生。而VEGF是血管发生的中枢调节因子，具有调控血管发生和维持血管内皮细胞的作用，可促进新生血管的形成。Li et al研究表明 Apelin-13可通过激活 PI3K／Akt信号通路，促进人视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和毛细血管样管道的形成；Huang et al研究表明，Apelin-13可显著增加动脉栓塞动物模型中VEGF及其受体VEGFR2的表达水平，其作用机制可能与Apelin-13能促进血管生成有关。这些涉及血管发生的因子可能成为诱导血管新生潜在研究靶点。本研究结果显示，Apelin-13可通过激活 VEGF／PI3K／Akt信号通路，上调成骨标记物水平，同时下调破骨标记物水平，增加骨折局部的新骨形成，促进大鼠股骨骨折愈合。

Micro CT可以直观地观察和定量分析组织的差异，清晰准确地了解骨折愈合的情况，是目前实验研究中最为可靠的检测骨显微结构的方法。本研究首先通过Micro CT测定各组大鼠的骨显微结构，同时通过X射线观察骨愈合情况，实验结果显示，股骨骨折模型组大鼠的骨密度、组织矿物质密度、骨体积分数以及股骨X射线评分较正常组均减小，与前人研究一致，给予高剂量Apelin-13治疗后，大鼠的骨显微参数和骨愈合情况均得到明显改善，骨痂直径较模型组明显增加。HE染色结果显示，模型组骨折端多为硬骨骨痂，伴随大量软骨细胞浸润生长，Apelin-13高剂量治疗组内外骨痂变薄，硬骨痂逐渐吸收，可见较多新生骨小梁结构，说明Apelin-13可促进软骨骨痂形成及向硬骨骨痂转变，从而促进骨愈合。

BALP是成骨细胞分化的早期标记物，可以反映成骨细胞的成熟和活性，能够促进骨基质的矿化及骨结构的形成；PINP是在骨基质形成过程中胶原代谢的产物，与成骨细胞的活性密切相关。袁功武等研究显示，吉非替尼治疗股骨骨折模型大鼠后，血清中BALP和PINP水平较对照组明显上升，说明吉非替尼可促进早期骨形成、成骨细胞分化和成熟。TRACP-5b是由破骨细胞合成和分泌的代谢酶，介导骨基质的降解过程，CTX是在骨吸收过程中Ⅰ型胶原蛋白降解的羧基端产物，与破骨细胞介导的骨吸收程度密切相关。本研究结果显示，与正常组比较，模型组BALP、PINP含量下降，TRACP-5b、CTX含量均上升，与前人研究结果一致；与模型组比较，Apelin-13高剂量治疗组大鼠血清中BALP、PINP含量上升，而 TRACP-5b、CTX含量下降，说明Apelin-13可促进成骨细胞的成熟和破骨细胞的重吸收功能，从而促进骨痂形成利于骨折愈合。

VEGF是促进血管生成的重要因子，众多研究认为 VEGF的高表达能促进骨折愈合，而PI3K／Akt信号通路是VEGF下游重要的信号通路之一，在血管生成的生理方面发挥着重要作用。多数研究认为PI3K／Akt通路促进血管形成的机制为：活化的Akt可通过磷酸化方式激活内皮型一氧化氮合酶（eNOS），eNOS可催化合成微量一氧化氮，而一氧化氮具有刺激血管舒张、血管重塑和血管生成等一系列过程的功能。为了进一步证实Apelin-13是否通过激活VEGF／PI3K／Akt信号通路促进大鼠股骨骨折愈合，本实验对模型组使用不同剂量Apelin-13进行干预治疗，研究结果显示，与模型组比较，Apelin-13高剂量组骨痂组织中VEGFA、VEGFR2、PI3K p85和 p-Akt蛋白表达水平上升，说明Apelin-13确是通过激活VEGF／PI3K／Akt信号通路来发挥股骨骨折愈合的促进作用。

综上所述，外源性 Apelin-13可通过调控VEGF／PI3K／Akt信号通路，改善股骨骨折大鼠的骨显微参数，促进成骨细胞成熟和破骨细胞重吸收，从而促进大鼠股骨骨折愈合。