安徽地区高黏液表型肺炎克雷伯菌分子流行病学研究

孙凯莉，刘 周，刘艳艳，李家斌，

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）在近几年已成为社区获得性感染和医院感染的重要病原体。高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HvKP）以能引起多部分脓肿的感染特征引起广泛关注，其具有的高黏液性与高毒力性均与其荚膜密切相关，实验室常根据高黏液表型来筛选。目前认为只依据高黏液表型来筛选会存在漏检，携带了毒力因子rmpA或者rmpA2的高黏液表型肺炎克雷伯菌（hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae，HMKP）更可能为 HvKP。HvKP目前在全球具有广泛的分布，多重耐药的HvKP临床分离株已出现，这使其治疗管理变得更加困难。该研究主要对比前后两年菌株分子流行病学特征变化，为临床合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2017年9月及2018年9月份安徽省26家医院的KP非重复临床分离株，筛选出具有高黏液表型的菌株。通过VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统对细菌进行鉴定。由安徽省细菌耐药中心提供药敏质控菌大肠埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.1.2 主要仪器和试剂 VITEK-2 Compact全自动细菌分析仪（法国公司Biomerieux）；生物安全柜（山东新华医疗器械股份公司）；细菌多点接种仪（英国AQSManufacturing公司）；PCR仪器（德国Biometra公司）；凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；琼脂糖和染料、PCR引物（上海生工生物公司）；10种药物（中国食品药物检定研究院）。

1．2 方法

1.2.1 黏液丝实验 用无菌接种环轻轻接触过夜培养好的新鲜菌落并向外牵拉，若两次黏液丝均大于5 mm即具有高黏液表型，该菌株则为HMKP。

1.2.2 药敏试验 参照2017版美国临床实验室标准协会推荐的标准判读结果，采用琼脂平板稀释法测定137株菌对于10种常用抗菌药物的最低抑菌浓度。

1.2.3 毒力基因及荚膜血清型检测 用煮沸法提取各菌株的DNA，采用PCR方法检测6种毒力基因，包括 aerobactin、magA、rmpA、rmpA2、iroNB、kfu，同样方法检测wzi获得不同的荚膜血清型，由上海生工生物有限公司合成所有引物。各菌株的PCR产物进行凝胶电泳后记录结果并进行比对。

1.2.4 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 参照MLST官网的引物序列合成管家基因（gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB），并进行扩增，由上海生工生物有限公司对PCR纯化后的产物进行测序。在 MLST数据库官网（http：／／bigsdb.pasteur.fr／klebsiella／）进行比对，得到各菌株对应的ST型。

表1 各年度HMKP对常用抗菌药药敏结果（%）

1．3 统计学处理

使用SPSS 22.0软件进行数据分析。两组样本间率的比较采用χ检验或Fisher精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 HMKP检出率

2017年分离出 KP为657株，从其中的18家医院分离出69株HMKP，分离率为10.50%；2018年分离出的KP为707株，从其中14家医院分离出68株HMKP，分离率为9.62%。

2．2 菌株分布情况

标本来源分布：两年里137株菌分离出的痰液标本有104株，尿液标本9株，脓液和分泌物标本各6株，血液标本5株，咽拭子4株，腹水、引流液、未知标本各1株。年龄段分布：1～49岁有17株，50～59岁21株，60～69岁36株，70～79岁42株，80～89岁17株，90～99岁4株。科室分布：菌株检出率在5株以上的科室有呼吸内科24株，ICU 17株，心内科10株，急诊科9株，神经外科、神经内科各8株，普外科、感染病科、肿瘤科各6株，泌尿外科5株。菌株主要疾病分布：脑部疾病25株，呼吸系统疾病17株，心血管疾病6株，恶性肿瘤11株。

2．3 药敏结果分析

2017年菌株对庆大霉素和左氧氟沙星的耐药率为0%，2018年菌株对庆大霉素、左氧氟沙星的耐药率分别为8.82%、7.35%。137株菌对于头孢曲松的耐药率最高，为5.84%。见表1。

2．4 毒力基因检测结果

2017年以 iroNB（91.30%）和 aerobactin（88.41%）的携带率最高，rmpA、rmpA2、kfu、magA分别为 66.67%、53.62%、44.93%和 13.04%。2018年以 aerobactin（88.24%）和 rmpA（80.88%）携带率最高，rmpA2、kfu、iroNB、magA分别为 63.24%、48.53%、33.82%和26.47%。两年的总菌株以aerobactin（88.32%）携带率最高，rmpA、iroNB、rmpA2、kfu、magA的携带率分别为 73.72%、62.77%、58.39%、46.72%、19.71%。

2．5 荚膜血清型检测结果

2017年以K2型为主，其次为K1型和 K23型，K14K4型、K14K64型、K2型、K20型、K21型、K5型、K54型、K57型、K63型各1株，其余未分型。2018年以K1型为主，其次为K2、K57、K63型，K14K64、K5型各 2株，K20、K23、K24、K25、K54型各1株，其余未分型。两年里137株菌以K2型和 K1型为主，K23、K57、K63型各4株，K14K64、K5型各 3株，K20、K54型各 2株，K14K4、K21、K24、K25型各1株，其余未分型。137株菌K1型包含14种毒力基因携带模式，而K2型包含19种毒力基因携带模式，见表2。

表2 各年份主要荚膜型主要的毒力基因携带模式

2．6 MLST分型

2017年（69株）分为27种 ST型别，以 ST65、ST23、ST86、ST412最常见，比例分别为 17.39%、14.49%、14.49%、13.04%。2018年（68株）分为 31种 ST型别，以 ST23、ST86、ST412、ST592为主，分别为 20.59%、10.29%、5.88%、5.88%。137株菌分为43种ST型，以ST23、ST86、ST65、ST412为主，分别为 17.52%、12.41%、10.95%、9.49%。见表3。

表3 137株高黏液性肺炎克雷伯菌的ST序列分型

2．7 rmpA或者rmpA2阳性组与阴性组的比较

在137株菌中，rmpA阳性组的毒力基因rmpA2携带率高于其阴性组，rmpA2阳性组的毒力基因kfu携带率高于其阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在137株菌中，rmpA阳性组中70～79岁的感染率要高于阴性组，同时rmpA2阳性组中70～79岁的感染率也高于阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 4、5。

表4 rmpA阳性组与阴性组的比较[n（%）]

表5 rmpA2阳性组与阴性组的比较[n（%）]

3 讨论

HMKP主要分离自具有心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肿瘤患者，可能与疾病导致抵抗力下降相关。目前碳青霉烯酶类药物仍是治疗HvKP感染的常用药，菌株对常用抗菌药耐药性仍较低。本研究表明2018年的HMKP对庆大霉素和左氧氟沙星的耐药率相较于2017年有所增加。

aerobactin和kfu为铁载体，rmpA与rmpA2具有极高的同源性且参与荚膜多糖的合成。magA负责K抗原的合成。iroNB也属于铁载体。本研究表明两年里都以aerobactin的检出率最高，以magA检出率最低。HvKP可根据荚膜多糖分为82个荚膜型，K1和K2型表现出更强的毒力，更易引起肝脓肿。本研究K1型和K2型都具有多种毒力基因携带模式，毒力基因的种类也比其他荚膜型更多，这可能与其相较于其他荚膜型危害性更强有关。

与 HvKP密切相关的 ST型有 ST23、ST65、ST86。该研究 2017年以 ST23为主，2018年以ST65为主。70～79岁更易感染携带了rmpA或者rmpA2毒力基因的HMKP。这个年龄段若感染了KP，在未判断出其是否为HvKP之前，可经验用抗HvKP的药。同时携带rmpA和rmpA2的HMKP更有可能是HvKP。实验室可将表型和基因型结合起来判断菌株是否为HvKP以便及时制定合理有效抗菌药物治疗方案，从而降低细菌耐药情况的发生。