Torin2对人甲状腺乳头状癌细胞株生物学行为影响的研究

孙洪莉，魏 枫，梁书卿，王晓艳，郑 朦，李冉浩

甲状腺癌（thyroid cancer，TC）发病率逐年上升，且以女性多见。2018年数据显示，全球TC发病率为6.7／100 000，而我国每年新增病例达 19万（194 232例）。人甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的类型，约占 TC的90%以上。手术是其主要治疗方法，但仍有30%病人术后出现复发和转移。近年来，随着生物技术的发展和相关研究的不断深入，分子靶向治疗已逐渐成为一个研究热点。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种蛋白激酶，位于PI3K-Akt-mTOR细胞信号通路的下游，与细胞的转录、翻译、增殖、代谢和转移等行为密切相关。研究表明TC中存在mTOR信号通路的过度活化，而 9-（6-氨基-3-吡啶基）-1-[3-（三氟甲基）苯基]苯并[H]-1，6-萘啶-2（1H）-酮（Torin2）作为一种新的二代mTOR抑制剂，对多种肿瘤细胞的生长和转移均有抑制作用。该研究以人PCT的TPC-1细胞为研究对象，进一步探究Torin2对PTC细胞的增殖、周期、凋亡、迁移的影响以期为今后靶向药物治疗PTC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TPC-1细胞株、Nthy-ori-3细胞株购自上海复旦细胞库；Torin2、RPMI 1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）粉末购自美国Sigma公司；细胞凋亡试剂盒Annexin V FITC购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 Nthy-ori-3细胞、TPC-1细胞均用含有10% FBS、90%的RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO、饱和湿度、无菌孵育箱培养。

1.2.2 MTT比色分析法检测细胞增殖抑制率 实验分组：100、200、400 nmol／L Torin2组、空白对照组。取对数期的2种细胞胰蛋白酶消化、收集、计数，按每孔100μl培养基含2×10个细胞均匀铺96孔板，贴壁后弃上清液加入各浓度Torin2，每组设6个复孔；分别于24、48、72 h在各孔加入20μlMTT溶液（5 g／L），37℃下孵育4 h；弃培养基，向各孔加入150μl二甲基亚砜，在振荡器上低速振荡10 min；用酶标仪检测490 nm处各孔吸光度（optical density，OD）值并计算细胞的增殖抑制率＝（对照组OD值-实验组OD值）／对照组OD值×100%。试验重复3次。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 实验分组同上，取对数期的2种细胞消化、收集，按每孔2 ml培养基以1×10个细胞均匀铺6孔板，贴壁后分别加入各浓度 Torin2，培养24、48 h；消化、收集细胞，加入预冷70%乙醇在-20℃固定过夜；离心、收集细胞，PBS洗涤，加终浓度为1 g／L的RNaseA，置于37℃水浴30 min；加终浓度为0.05 mg／L的 PI染料溶液，室温下黑暗反应30 min；流式细胞仪分析488 nm处激发波长荧光强度。试验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞接种、实验分组、培养时间均同周期，收集细胞，依次加入5μl AnnexinV-FITC、5μl PI，轻轻混匀，室温（20～25℃）下避光孵育10～15 min；随即上机检测。

1.2.5 划痕愈合试验检测细胞迁移能力 取对数期的TPC-1细胞，细胞接种、实验分组均同周期，细胞贴壁后弃上清液，用200μl的移液枪头在在预定的直线位置划“一”字划痕；用无血清培养基洗涤各孔；加入各浓度Torin2，培养24 h；分别在0、24 h拍摄并测量划痕区域面积，计算细胞划痕愈合率（%）＝（1-24 h的划痕区域面积／0 h的划痕区域面积）×100%。试验重复3次。

2 结果

2．1 不同浓度Torin2对人正常甲状腺Nthy-ori-3细胞系增殖的影响

用不同浓度（100、200、4

00

nmol／L）的 Torin2处理 Nthy-ori-3细胞 24、48、72 h后，与用药前空白对照组（0 nmol／L Torin2）相比，增殖抑制率无变化，差异无统计学意义。

2．2 不同浓度Torin2对人PTC的TPC-1细胞增殖的影响

与空白对照组相比，随着Torin2浓度的增加，作用时间的延长，对TPC-1细胞增殖的抑制率增高，抑制细胞增殖的能力增强；当处理时间一定时，TPC-1细胞的增殖抑制率随着Torin2浓度的增加而逐渐增高，各加药组组间比较差异有统计学意义（F＝180.019，P＜0.001；F＝163.924，P＜0.001；F＝65.882，P＜0.001）；在同一浓度组，细胞增殖抑制率随时间延长逐渐增加，各加药组组间比较差异有统计学意义（F＝135.918，P＜0.001；F＝277.068，P＜0.001；F＝1 013.334，P＜0.001），实验显示Torin2可抑制TPC-1细胞的增殖。见表1、图1。

表1 不同浓度Torin2对TPC-1细胞增殖抑制率影响（%，n＝3，±s）

图1 不同浓度Torin2对TPC-1细胞株作用不同时间的抑制率的影响

2．3 不同浓度的Torin2对人正常甲状腺Nthy-ori-3细胞系周期的影响

经不同浓度Torin2对Nthyori-3细胞作用不同时间后，与对照组（0 nmol／L）相比，细胞各个时期DNA含量几乎无差异。此结果提示Torin2对细胞的周期无显著影响。

2．4 不同浓度Torin2对人PTC的TPC-1细胞周期的影响

经不同浓度Torin2处理TPC-1细胞作用24、48 h后，与对照组相比，G期细胞比例逐渐增加（F＝150.141，P＜0.001；F＝128.909，P＜0.001），S期细胞比例逐渐减少（F＝140.625，P＜0.001；F＝92.961，P＜0.001），差异有统计学意义，而 G期，Torin2并未对其有影响（F＝1.032，P＝0.429；F＝2.071，P＝0.183）；同一浓度作用下，随着作用时间的延长，G期DNA含量逐渐增加（F＝60.522，P＝0.001），S期的含量逐渐下降（F＝105.991，P＝0.001），差异有统计学意义；3种浓度相比，400nmol／L的Torin2 G期细胞比例最高，S期细胞比例较低，差异有统计学意义（P＜0.001）。以上结果提示用Torin2处理后，TPC-1细胞的细胞分裂周期在G期被阻断，此时TPC-1细胞的存活、生长受到抑制，这种抑制作用随Torin2浓度的增加而增强，400 nmol／L的Torin2对TPC-1细胞周期的阻滞作用最强，呈时间和浓度依赖性。见表2、图2、图3。

表2 不同浓度Torin2作用不同时间对人PTC的TPC-1细胞周期影响（%，n＝3，±s）

图2 不同浓度Torin2对PTC的TPC-1细胞作用不同时间细胞周期的分布图

2．5 不同浓度的Torin2对人正常甲状腺Nthy-ori-3细胞系凋亡的影响

经不同浓度的Torin2处理Nthy-ori-3细胞24、48 h后，与对照组（0 nmol／L）相比，凋亡率无明显不同（F＝0.098，P＝0.959；F＝1.345，P＝0.325）。

2．6 不同浓度Torin2对人PTC的TPC-1细胞凋亡影响

与对照组（0 nmol／L）相比，不同浓度的Torin2作用于人乳头状甲状腺癌TPC-1细胞24、48 h，细胞凋亡率均上升，且随浓度的增加凋亡率逐渐上升（F＝385.736，P＜0.001；F＝429.731，P＜0.001），差异有统计学意义，但随着时间的延长，凋亡率并无增加（P＞0.05）。见表3、图4、图5。

2．7 不同浓度的Torin2对人PTC的TPC-1细胞

迁移的影响

统计各浓度Torin2处理TPC-1细胞24 h划痕愈合率分别为（38.48±1.77）%、（26.65±0.59）%、（15.98±1.55）%，与对照组（49.82±2.14%）相比差异有统计学意义（F＝245.272，P＜0.001），且随着Torin2浓度增加，划痕愈合率逐渐降低，此结果提示Torin2对细胞迁移能力的抑制越来越强。见图6、7。

表3 人PTC的TPC-1细胞在不同浓度Torin2作用下的凋亡率（%，n＝3，±s）

3 讨论

PI3K／Akt／mTOR信号通路已被发现在多种肿瘤细胞中异常激活，是癌症发生发展中重要的基因信号通路。mTOR位于该通路的下游，活化后通过介导下游重要信号分子而影响细胞增殖、凋亡、代谢等生理活动，mTOR通路的过度激活是许多肿瘤重要的致瘤机制之一。所以此信号通路将极可能成为治疗PTC的一个有效的靶点。mTOR抑制剂不仅可以抑制癌细胞增殖、生长，还可以抑制肿瘤转移，减少肿瘤血管新生成，其主要包括雷帕霉素及相关类似物（如西罗莫司、依维莫司等）、ATP竞争性抑制剂、能同时抑制PI3K和mTORC1／2的双重抑制剂。研究表明，Torin2作为一种新型的第二代ATP竞争性抑制剂，其对mTOR具有强效和选择性，在细胞生长抑制方面表现出比雷帕霉素更大的效力，其药代动力学特性优于以前的抑制剂，已成为研究的一个热点方向，是一种很有前景的肿瘤靶向治疗药物。本研究通过MTT实验检测了不同浓度的Torin2对TPC-1细胞系和Nthy-ori-3细胞系的作用。结果显示，Torin2对Nthy-ori-3细胞的增殖无明显抑制作用；但用不同浓度Torin2处理TPC-1细胞24、48、72 h后，对其生长具有明显的抑制效应，且具有浓度和时间依赖性，与 Wang et al对肝癌细胞的研究中发现Torin2可抑制细胞增殖并诱导凋亡结果相类似。因此推断Torin2作用于TPC-1细胞株可以抑制mTOR信号通路，可以使肿瘤细胞的生长受到抑制，癌细胞生存率降低。

图3 不同浓度Torin2对TPC-1细胞作用不同时间细胞周期的百分比

图4 不同浓度Torin2作用不同时间的TPC-1细胞凋亡率的分布图

图5 不同浓度Torin2作用不同时间对TPC-1细胞凋亡率的影响

图6 不同浓度Torin2处理人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞24 h的划痕分布

图7 不同浓度Torin2对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞迁移的影响

该研究为进一步探索Torin2抑制TPC-1细胞生长的作用机制，进行了流式细胞分析，细胞周期结果显示：应用Torin2后对Nthy-ori-3细胞周期无影响；相反，在TPC-1细胞中，随着Torin2浓度的增加和作用时间（24、48 h）的延长，G期的细胞比例逐渐增加，S期的比例逐渐下降。结果表明，Torin2可将TPC-1细胞周期阻滞于G期（即DAN合成的前期）无法继续进行细胞分裂，从而影响癌细胞增殖。

该研究还进行了凋亡的检测，用不同浓度的Torin2处理甲状腺细胞株，结果显示Nthy-ori-3细胞的凋亡率无明显变化；在TPC-1细胞中，随着Torin2作用浓度的增加，TPC-1细胞的凋亡率亦明显上升，呈现浓度依赖效应。然而，随着作用时间（24、48 h）的延长，凋亡率没有明显增加，进一步证实，Torin2可促进TPC-1细胞的凋亡。此外，该研究结果还显示，Torin2可抑制TPC-1细胞的迁移，且随着浓度的增加，抑制能力越强，说明Torin2可通过抑制癌细胞的转移而起到抗肿瘤的作用。

以上结果均与皮国成的研究结果一致。而且Sadowski et al曾在未分化甲状腺癌的小鼠模型中使用Torin2后显示其抑制肿瘤生长和转移并显著延长总体存活率，此结果提示Torin2对mTOR具有强效和选择性，具有强大的抗肿瘤作用。