芦笋及其不同萃取物对CCl4致急性肝损伤的保护作用的比较

胡亚敏，李跨越，刘 兰，杜 娜，潘学胜，朱月琴，程文明，吴 丽，黄 艳

芦笋，学名石刁柏（Asparagus officinalis L.），天门冬属百合科植物，药食同源且营养价值丰富，区别于传统药用植物如何首乌、雷公藤等的大毒特性，芦笋的安全性高。动物实验证明芦笋具有免疫调节、降糖降脂、抗氧化等作用，鲜榨芦笋汁具有保肝效果。临床试验确证芦笋胶囊可治疗灼口综合征，芦笋口服液可用于癌症辅助治疗。由于芦笋品种及选育年份的差异，其包含的活性物质含量和种类也存在差异，且我国自主研发品种瓯峰芦笋尚未有关于保肝药效的相关研究，故该文以芦笋新品种瓯峰芦笋为研究对象，以常用保肝药物活性评价的CCl诱导的急性肝损伤模型来探讨新品种芦笋制备的提取物是否具有预防CCl所致急性肝损伤作用及相应的药效部位，以期为该品种芦笋作为保肝天然产物的开发及保肝药物的添加剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康昆明小鼠，体质量（25±2）g，雄性，由安徽医科大学动物实验中心提供，动物房标准饲养条件下饲养。所有实验操作方案经安徽医科大学动物伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与材料

提取罐购自上海顺仪厂；旋转蒸发仪购自德国IKA公司；全自动生化分析仪购自深圳Mindray公司；酶标仪购自美国Thermo公司；AB-8树脂购自东鸿化工有限公司。芦笋干品由江西瓯峰有机芦笋实验基地于2018年5月提供。

1.3 主要试剂

95%乙醇、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（国产分析纯）；联苯双酯、橄榄油、CCl购自合肥拜尔迪公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）测定试剂盒购自深圳Mindray公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒及总胆汁酸（total bile acid，TBA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 芦笋全方和不同极性提取部位的制备 取芦笋干品20 kg纱布包裹，提取罐中以10倍量的95%乙醇60℃条件下加热回流提取3 h，回流液蒸发至干，重复操作2次，得浸膏2.7 kg，取少量浸膏冷冻干燥制得芦笋冻干粉样品。剩余芦笋浸膏，适量水分散，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，收集各有机溶剂层及剩余水层，溶剂蒸干得相应部位浸膏并冷冻干燥。分别获得石油醚部位浸膏[得率（质量分数）5.47%]、乙酸乙酯部位浸膏（得率1.05%）、正丁醇部位浸膏（得率4.68%）。正丁醇部位采用AB-8树脂进行30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇梯度冲洗，蒸干，冷冻干燥得到相应洗脱物。得率分别是 2.36%、1.25%、0.52%、0.21%。

1.4.2 动物灌胃药液的制备 称取芦笋全方冻干粉和各部位冻干粉适量，用蒸馏水加热超声助溶，配制成芦笋提取物全方和不同提取部位药液，用于动物给药。最终配得95%乙醇提取物（extract of the ethanol，ETOH）（40 mg／ml）、石油醚萃取物（petroleum ether extract，PE）（20 mg／ml）、乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate extract，EE）（20 mg／ml）、正丁醇萃取物（butanol extract，BE）（20 mg／ml）、30%乙醇洗脱物（30% ethanol eluate of butanol extract，BEA）（10 mg／ml）、50%乙醇洗脱物（50% ethanol eluate of butanol extract，BEB）（10 mg／ml）、70%乙醇洗脱物（70% ethanol eluate of butanol extract，BEC）（10 mg／ml）、90%乙醇洗脱物（90% ethanol eluate of butanol extract，BED）（10 mg／ml）。

1.4.3 动物分组、造模及给药

1.4.3.1 芦笋ETOH及其萃取物实验分组 SPF级KM小鼠42只，随机分为正常组、模型组、芦笋ETOH给药组及其3个萃取物组（PE给药组、EE给药组、BE给药组）、阳性对照组（联苯双酯）。芦笋各给药组（ETOH、PE、EE、BE）和阳性对照组灌胃给药，每天1次，连续给药7 d，正常组小鼠和模型组小鼠给予等体积双蒸水。末次给药2 h后，除正常组外，其余各组小鼠均腹腔注射0.25% CCl（0.1 ml／10 g）溶液制备急性肝损伤模型，正常组小鼠腹腔注射等体积的橄榄油。

1.4.3.2 芦笋正丁醇提取物及其梯度乙醇洗脱物实验分组 SPF级KM小鼠48只，随机分为正常组、CCl模型组、BE给药组、4个芦笋正丁醇萃取不同洗脱物组[30%乙醇洗脱物（BEA）给药组、50%乙醇洗脱物（BEB）给药组、70%乙醇洗脱物（BEC）给药组90%乙醇洗脱物（BED）给药组]、阳性对照组（联苯双酯）。小鼠处理方法同1.4.3.1。

1.4.4 血清及肝组织的采集 造模后小鼠禁食不禁水16 h，眼眶取血，分离血清，置于-80℃冰箱保存，用于检测血清AST、ALT以及TBA；小鼠采血后颈椎脱臼处死，75%乙醇消毒后，取肝脏标本，经0.9%氯化钠溶液漂洗后，剩余部分滤纸吸干，迅速冻于-80℃冰箱，用于肝组织SOD、MDA含量的测定。

1.4.5 血清生化指标的测定 经眼眶取血，4℃静置2 h，以3 000 r／min离心20min分离血清，按照试剂盒使用说明测定肝脏AST、ALT及TBA含量。

1.4.6 肝组织匀浆生化指标的测定 剪取肝组织0.1 g，0.9%氯化钠溶液漂洗，滤纸吸干，置于2 ml离心管，加入9倍0.9%氯化钠溶液，匀浆机打碎，离心30 min（12 000 r／min，4℃），取上清液，按照试剂盒使用说明，测定肝组织中MDA和SOD含量。

1.4.7 肝组织病理形态学观察 眼眶采血后颈椎脱臼处死小鼠，迅速解剖，取出肝脏，取每个样本相同位置的新鲜肝右叶，0.9%氯化钠溶液漂洗，去除胆囊，浸入4%多聚甲醛中固定过夜，经脱水、透明、浸蜡、包埋制备石蜡切片，切片脱蜡至水，经苏木精-伊红染色，流水冲洗，透明，封片。染色结果置于显微镜下观察并采集图像。

1.4.8 抗氧化物质成分分析 根据文献方法对芦笋已报道的抗氧化物质如酚酸类、黄酮类物质进行检测。

1.4.8.1 没食子酸标准曲线的绘制 称取33.5 mg没食子酸粉末溶于5 ml双蒸水制备没食子酸标准品溶液；取0.3 ml没食子酸标准品溶液加双蒸水至 9.095 ml，得母液浓度 0.221 mg／ml。分别取适量没食子酸母液 0.075、0.150、0.225、0.300、0.375、0.450、0.525、0.600 ml于试管并加双蒸水至0.75 ml，各试管分别加入 0.1 mol／L FeCl溶液 0.15 ml、0.008μmol／L KFe（CN）溶液 0.15 ml、0.1 mol／L HCl溶液0.15 ml，双蒸水补足至7.5 ml，摇晃混匀，于波长760 nm条件下测量吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线。并配置不同浓度的供试品，使其吸光度范围在标准曲线范围内。

1.4.8.2 芦丁标准曲线的绘制 取20 mg芦丁粉末溶于40 ml 70%乙醇，摇匀制备芦丁标准品溶液；取芦丁标准品溶液3 ml稀释至7.5 ml，得母液浓度0.2 mg／ml。分别取芦丁母液 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 ml于10 ml试管，加70%乙醇至1.8 ml，加入5% NaNO溶液0.3 ml，摇匀静置6 min后，再加入 10% Al（NO）溶液 0.3 ml，摇匀静置 6 min，加入4% NaOH溶液3 ml，最后补加70%乙醇至7.5 ml，摇晃混匀，于波长510 nm条件下测量吸光度。以吸光度值为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。并配置不同浓度的供试品，使其吸光度范围在标准曲线范围内。

1.5 统计学处理

采用Graphpad Prism 7软件进行统计分析，多组数据差异比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 芦笋 ETOH及其萃取物（PE、EE、BE）对急性肝损伤小鼠血清AST、ALT活性的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清 AST（F＝54.93，P＜0.001）、ALT（F＝32.41，P＜0.001）升高，结果提示造模成功。与模型组相比，PE和EE给药组小鼠血清AST、ALT无统计学差异，联苯双酯可降低模型小鼠血清AST、ALT水平（P＜0.001）；ETOH和BE给药组降低CCl诱导的肝损伤小鼠的血清AST、ALT表达水平（P＜0.05或 P＜0.01）。见表1。

表1 芦笋ETOH及其萃取物（PE、EE、BE）对CCl4致急性肝损伤小鼠的血清AST、ALT活力的影响（n＝6，±s）

2．2 芦笋 ETOH及其三组萃取物（PE、EE、BE）对急性肝损伤小鼠血清TBA以及肝匀浆 MDA、SOD表达水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清TBA含量升高（F＝15.8，P＜0.001），肝组织匀浆MDA（F＝15.83，P＜0.001）表达水平显著升高，SOD含量显著下降（F＝22.59，P＜0.001），以上结果提示造模成功；与模型组相比，PE和EE给药组小鼠血清TBA及肝组织MDA、SOD含量差异无统计学意义；联苯双酯降低模型小鼠血清TBA含量（P＜0.001），降低小鼠肝组织MDA和提高SOD表达水平（P＜0.001）；ETOH和BE给药组降低CCl诱导的肝损伤小鼠的血清TBA以及肝组织MDA表达水平，升高模型小鼠肝组织SOD表达水平（P＜0.05或P＜0.01）。见图1。

2．3 芦笋 ETOH及其三组萃取物（PE、EE、BE）对急性肝损伤小鼠肝脏病理变化的影响

HE染色结果显示正常组肝细胞结构完整，排列紧密，肝索结构完整，细胞核质界限较为清晰，未见肝细胞坏死等病理改变。模型组肝细胞结构不完整，肝组织呈现大范围的溃烂，灶状坏死；PE和EE给药组呈现大范围灶状坏死区域以及炎性细胞浸润；与模型组相比，BE、ETOH、联苯双酯给药组灶状坏死区域面积明显减少且炎性细胞浸润状况较轻。见图2。

2．4 BE及其各梯度乙醇洗脱物（BEA、BEB、BEC、BED）对CCl致急性肝损伤小鼠的血清AST和ALT酶活力的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清AST酶水平升高（F＝23.17，P＜0.001），ALT酶活力上调（F＝33.59，P＜0.001），结果说明造模成功。与模型组相比，联苯双酯、BE和BEA给药组降低CCl诱导的肝损伤小鼠的血清AST、ALT酶活力（P＜0.05或P＜0.01）且BEA给药组较BE组效果显著，而BEB、BEC和BED三组未显示出统计学差异。见表2。

图1 芦笋ETOH及其萃取物（PE、EE、BE）对急性肝损伤小鼠血清TBA以及肝匀浆MDA、SOD表达水平的影响

图2 ETOH及三组萃取物给药组小鼠的病理变化 HE×400

表2 BE及其各梯度乙醇洗脱物对CCl4致急性肝损伤小鼠的血清AST、ALT酶活力的影响（n＝6，±s）

2．5 BE及其各梯度乙醇洗脱物对CCl致急性肝损伤小鼠的血清TBA以及肝匀浆MDA、SOD表达水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清TBA含量升高（F＝10.03，P＜0.001），肝组织MDA水平升高（F＝24.65，P＜0.001），SOD活力下降（F＝21.07，P＜0.001），结果表明造模成功；与模型组相比，BEB、BEC、BED三个给药组小鼠血清TBA含量及肝组织MDA、SOD含量未显示统计学差异；阳性药联苯双酯降低小鼠血清TBA及肝组织MDA，升高SOD含量（P＜0.05，P＜0.001）；BE、BEA给药组小鼠血清TBA及肝组织MDA、SOD与模型组相比差异显著（P＜0.05）且BEA给药组较BE给药组差异更大。见图3。

2．6 BE及其各梯度乙醇洗脱物对CCl致急性肝损伤小鼠肝脏病理变化的影响

由病理切片可知，正常组肝细胞结构完整，排列紧密，肝索结构完整，肝细胞核质较分明；模型组肝细胞结构不完整，肝组织呈现大范围的灶状坏死以及炎性细胞浸润并伴随脂肪空泡；与模型组相比，BEB、BEC、BED三个给药组肝脏病理组织呈现大范围灶性状死区域，无明显区别；BE、BEA给药组及联苯双酯给药组灶状坏死区域面积减少，肝细胞排列相对完整紧密。见图4。

2.7 有效部位的成分分析

酚酸类物质以没食子酸为标准，没食子酸标准浓度在0.021 1～0.126 6之间与吸光度成线性，ETOH、BE及BEA在浓度分别为6.7、6.7、0.872 mg／ml时吸光度在标准曲线范围内，结果测得ETOH和BE及BEA中酚酸浓度分别为1.38%、1.39%、7.23%。见表3、4及图5。黄酮类化合物以芦丁为标准得芦丁浓度在0.2～1.2 mg／ml之间与吸光度成正比，ETOH、BE及BEA在浓度为5 mg／ml时，吸光度在标准曲线范围内，结果测得ETOH、BE及BEA黄酮类化合物浓度分别为5.20%、7.06%、13.80%。见表5、表6、图6。

图3 BE及其各梯度乙醇洗脱物对CCl4致急性肝损伤小鼠的血清TBA以及肝组织匀浆MDA和SOD含量变化的影响

图4 BE及BEA、BEB、BEC、BED对CCl4致小鼠急性肝损伤的病理影响 HE×400

表3 没食子酸标准曲线浓度

表4 ETOH、BE、BEA三类样品中没食子酸测定浓度及含量

图5 没食子酸标准曲线

表5 芦丁标准曲线浓度

表6 ETOH、BE、BEA三类样品中没食子酸测定浓度及含量

图6 芦丁标准曲线

3 讨论

CCl制备的急性肝损伤模型能准确反映肝细胞受损时各种生理病理变化。CCl在细胞色素酶CYP450作用下，生成三氯甲基 （·CCl）等自由基直接改变或破坏细胞膜，使位于肝细胞内大量AST、ALT释放到外周循环血液中，因此外周血清中ALT、AST活力升高与肝组织损伤程度与范围呈直接相关性。TBA是胆汁的主要成分，由肝细胞合成并随胆汁分泌到十二指肠，通过肝肠循环再次被重吸收入肝。当肝细胞损伤时，会引起胆汁酸的代谢障碍，血清中TBA浓度随着肝细胞损害程度而升高，TBA也可在一定程度上反应肝损伤程度。

CCl造成的肝损伤中，氧化应激在其中扮演重要角色。MDA是脂质过氧化反应的终产物之一，攻击生物膜，导致细胞肿胀、坏死，常作为脂质过氧化的指标，其含量的高低反映了组织过氧化的损伤程度。SOD是体内清除自由基、抑制自由基反应最重要的抗氧化酶之一，它可减少自由基的生成进而减少肝细胞的损伤。

本研究通过CCl致损伤急性肝损伤模型，观察芦笋提取物各不同极性组分对其保护作用的差异。模型组小鼠血清ALT、AST、TBA水平均显著增加，肝脏病理切片显示肝细胞大范围破碎、坏死，表明造模成功。与模型组比较，PE及 EE给药组 AST、ALT、TBA无明显差异，肝匀浆MDA、SOD含量亦无明显差异，整体角度上PE、EE给药组没有预防CCl致肝损伤作用，可能是因为其中存在活性物质，但含量很低，在混合物复合效应的掩盖下没有呈现。有文献报道乙酸乙酯萃取物中存在含量极低的药效成分（22E，24S）-5α，8α-epidioxy-24-methylcholesta-6，22-dien-3β-o和 5α，8α-epidioxy-（20S，22E，24R）-ergosta-6，22-dien-3β-ol，二者可明显抑制肝星状细胞的增殖，也可能在CCl诱导的肝损伤方面发挥作用。然而，在整体动物模型中尚未显示出EE给药后的保肝活性，究其原因可能是二者原材料来源不同。文献报道来源为山东曹县提供的芦笋，本实验所用芦笋为瓯峰商业有机芦笋，且为去除芦笋顶端部位，在相关药物成分的含量上二者可能有所差异。

有文献报道上海蔬菜园提供的芦笋副产品正丁醇部50%乙醇冲洗部位能明显改善高脂饮食饲养的小鼠肝脏氧化程度。为了进一步探究瓯峰商业有机芦笋正丁醇部位是否存在药效更好组分以及是否50%乙醇冲洗部位为抗CCl致急性肝损伤活性部位，正丁醇部位用AB-8树脂进一步细分，以30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇进行梯度冲洗，得到相应组分（BEA、BEB、BEC、BED）。药效学评价结果显示江西瓯峰商业芦笋BEA组分具有最佳预防CCl所致急性肝损伤的作用。然而其50%乙醇冲洗部位未呈现药效，究其原因除芦笋原材料来源不同，提取方法不同进而导致提取物相应成分在种类以及含量上的差异。上海蔬菜园来源的芦笋采用70%乙醇，在80℃条件下提取，过大孔树脂柱时仅有水和50%乙醇进行冲洗；而本实验采用的江西商业有机芦笋在95%乙醇，60℃条件下提取，极大地保存了物质的丰度和含量，同时过大孔树脂柱时在水和50%乙醇冲洗之间加了30%乙醇进行冲洗，可能导致原本在50%乙醇富集成分物质相关浓度未达到所需药效浓度从而未展现出相应的防治CCl所致急性肝损伤的作用；同时二者选用模型的不同也是差异的关键，该文选用的为CCl致急性肝损伤模型，在肝脏损伤程度上较高脂诱导的肝损伤要更为严重。

大量文献表明，芦笋中已发现抗氧化活性物质也主要为酚酸类、黄酮类两大类物质，故对此有效部位进行这两类物质的检测。结果表明芦笋ETOH、BE及BEA在酚酸含量和黄酮含量上存在一定程度的富集。这也间接解释了芦笋ETOH以及BE、BEA呈梯度性保肝效果的原因。ETOH中黄酮含量5.20%，而BE中黄酮含量7.06%，黄酮类物质的富集可能是BE药效高于ETOH原因之一。BE和BEA在酚酸和黄酮含量均有不同——BE中酚酸含量1.39%，黄酮含量7.06%；而BEA中酚酸含量7.23%，黄酮含量13.80%。酚酸和黄酮类物质的富集可能是芦笋BEA在预防CCl诱导的肝损伤上效果优于BE原因之一。

综上所述，江西商业新品种芦笋ETOH具有预防CCl诱导的肝损伤作用，且药效部位集中在极性较大组分BEA。BEA的初步保肝效果可能是通过抗氧化应激、降低胆汁酸方面发挥保护作用，但BEA组分具体药效机制有待在后续的实验中进一步探究。