二甲双胍对2型糖尿病模型大鼠肾组织巨噬细胞移动抑制因子及其受体CD74表达的影响

刘佳瑞，叶山东，毕双杰，周 婉

糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见的慢性微血管并发症，炎症、氧化应激及足细胞受损均参与并促进其发生发展。足细胞特异性相关蛋白如足糖萼蛋白（podocalyxin，PCX）以及尿白蛋白排泄增加有助于糖尿病肾脏损害的早期发现和诊断。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitor factor，MIF）可在CD74刺激下迅速分泌，并通过刺激足细胞CD74受体促进炎症反应。二甲双胍（metformin，MET）作为各大糖尿病指南广泛推荐的降糖药物，对糖尿病肾脏可提供保护作用，其确切机制尚不明确。既往研究表明，MET可通过抑制MIF-CD74轴介导的炎症级联反应在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者中发挥足细胞保护作用。该研究将从动物角度进一步观察MET对T2DM大鼠肾组织MIF、CD74、PCX表达及尿PCX排泄水平的影响，旨在初步探讨MET对T2DM大鼠肾脏的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级2月龄雄性（♂）SD大鼠44只，体质量（200±20）g，由安徽医科大学动物中心提供。实验期间，12 h光照-12 h黑暗交替照明，室温（19±1）℃，自由进食。链脲佐菌素购自美国Sigma公司；MET购自上海施贵宝制药公司；格列本脲购自天津太平洋制药公司；PCR试剂盒及引物、TRIzol试剂购于大连TaKaRa公司；Western blot试剂购自北京化学试剂公司；白蛋白放射免疫试剂盒购于天津市协和公司；肌酐、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒购自南京建成科技公司；尿MIF、CD74和PCX ELISA试剂盒购自武汉基因美科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型大鼠制备 大鼠随机分为对照组（NC组，n＝10，常规正常喂养）和高脂喂养组（n＝34，普通饲料＋10%猪油＋2%胆固醇）。喂养4周后，高脂喂养组予链脲佐菌素30 mg／kg（溶解于现配制的0.1 mmol／L枸橼酸缓冲液中，pH＝4.4）腹腔一次性注射，NC组予以等量枸橼酸缓冲液腹腔注射。链脲佐菌素腹腔注射72 h后，尾静脉采血测大鼠空腹血糖（采血前各组大鼠禁食8 h，正常饮水），测得血糖≥16.7 mmol／L即造模成功，共30只。成模大鼠随机分为3组，分别给予MET[MET组，n＝10，300 mg／（kg·d）]、格列本脲[GLY组，n＝10，5 mg／（kg·d）]、0.9%氯化纳溶液（DM组，n＝10），每日上午9：00—10：00灌胃给药，且连续高脂饮食喂养。干预8周后，代谢笼收集12 h随机尿液前所有实验大鼠禁食24 h，置该尿液于-40℃冰箱，待测尿白蛋白、尿MIF、CD74、PCX和尿肌酐（urine creatinine，Ucr）；腹主动脉插管留取血标本（10%水合氯醛腹腔注射麻醉）待测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）及BUN；肾组织取出后，去肾表面包膜同时0.9%氯化钠溶液反复冲洗，将右肾部分组织于液氮中保存，用于荧光定量PCR及Western blot检测，余下肾组织用以观察各组肾脏病理改变。

1.2.2 生化指标检测 HPLC系统测定HbA1c，尿酶法测定血BUN，苦味酸比色法测定Ucr，放射免疫分析法测定UAlb，ELISA法检测尿MIF、CD74和PCX。分别计算尿白蛋白、MIF、CD74、PCX与 Ucr比值[分别表示为尿白蛋白／肌酐（urinary albumin／Ucr，UACR）、尿 MIF／肌酐 （urinary MIF／Ucr，UMCR）、尿 CD74／肌酐（urinary CD74／Ucr，UCCR）和尿PCX／肌酐（urinary PCX／Ucr，UPCR）]。

1.2.3 肾小球透射电镜检测 2.5%戊二醛固定1 mm肾皮质小块，制成60～80μm超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色并清洗后于10 000×电镜下观察，随机测量5处肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）厚度并取其平均值作为基底膜平均厚度（glomerular basement membrane thickness，GBMT），GBM上融合足突的总长度／GBM的总长度为足突融合率（RFFP），同时观察GBM及足细胞形态学改变。

1.2.4 荧光定量PCR检测肾组织MIF、CD74、PCX mRNA表达水平 TRIzol法提取肾组织RNA，2μg总RNA逆转录为cDNA，SYBY Green试剂对产物进行荧光定量PCR。使用ABI 7500型扩增仪，荧光染料法进行目的基因扩增（总反应体系20μl）。对目的基因及内参（β-actin）进行扩增时，均设置3个复孔（注意避免体系贴壁或产生气泡，加样完成后立即扩增），运用 ΔΔCt法分析 Ct值，2表示目的基因mRNA表达拷贝数与β-actin拷贝数的比值。见表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot检测肾组织 MIF、CD74、PCX蛋白表达 RIPA法提取肾组织总蛋白，取50μg蛋白通过SDS-PAGE电泳分离并转移至PVDF膜，封闭，一抗 MIF（1∶1 000）、CD74（1∶300）、PCX（1∶1 000）于4℃孵育过夜，洗膜，二抗（1∶10 000）持续孵育1 h，随之进行化学发光反应，化学发光图像分析系统定量分析免疫印迹结果。

2 结果

2.1 各组生化指标比较

8周末，与NC组比较，其他各组 FBG、HbA1c、BUN、UACR、UMCR、UCCR和UPCR水平均升高（P＜0.05）；与 DM组相比，MET组和GLY组上述指标下降（P＜0.05）；与GLY组比较，MET组 BUN、UACR、UMCR、UCCR、UPCR降低（P＜0.05），两组间FBG和HbA1c差异无统计学意义。见表2。

2.2 肾小球病理改变

NC组GBM薄厚均匀，结构清晰，且足细胞形态正常且结构完整、足突基本未发生融合并呈整齐排列；DM组GBM呈弥漫增厚，结构模糊不清，足突增宽融合、脱离甚至消失；MET组、GLY组肾GBMT和足突融合程度较DM组均有改善，且两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与NC组相比，DM组GBMT升高（P＜0.05），足突融合率（foot process fusion rate，FRFP）＞80%；与 DM组比较，MET组和GLY组GBMT降低，且MET组低于GLY组（P＜0.05），MET组FRFP＜50%，GLY组FRFP约60%。见图1、表3。

2．3 各组大鼠肾组织 MIF、CD74、PCXmRNA表达的比较

与 NC组比较，其他各组 MIF、CD74 mRNA表达水平均升高，PCX mRNA表达水平降低；MET组和GLY组MIF、CD74 mRNA表达水平低于DM组，PCX mRNA表达水平升高，且MET组低于GLY组（P＜0.05）。见表3。

2．4 各组大鼠MIF、CD74、PCX蛋白表达的比较

Western blot结果显示：与NC组比较，其他各组MIF、CD74蛋白相对表达量均升高，PCX蛋白相对表达量降低；MET组和GLY组MIF、CD74蛋白相对表达量低于DM组，PCX蛋白相对表达量升高，且MET组优于GLY组（P＜0.05）。见图2。

表2 各组生化指标比较（±s，n＝10）

图1 各组肾脏电镜下病理改变 ×10 000

表3 各组GBM T、M IF、CD74及PCX m RNA表达的比较（±s，n＝10）

图2 各组肾组织M IF、CD74及PCX蛋白表达

3 讨论

尿白蛋白和肾小球足细胞标志蛋白排泄增加是糖尿病肾脏损害的早期敏感标志。糖尿病肾病早期阶段，许多生物标志物能够反映肾脏在肾单位特定部位的损伤，如尿PCX可反映足细胞受损程度且与糖尿病患者UACR呈正相关。MIF是广泛表达的多效细胞因子，它可通过刺激CD74受体及其他机制在肾小球足细胞中促进炎症反应。有研究表明糖尿病患者尿MIF和CD74排泄水平高于正常对照组，且与糖尿病足细胞损伤程度呈正相关。转录组学分析还显示，高血压肾病中组织肾CD74 mRNA增加。

MET作为治疗T2DM患者的使用最广泛的降糖药物，近年来不少研究显示MET尚可通过调节糖脂代谢，激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），减轻线粒体、内质网应激以及减少糖基化终末产物等发挥降糖之外的肾脏保护作用。有研究报道MET可通过减少糖尿病大鼠PCX表达改善足细胞损伤，表明MET对糖尿病诱导的足细胞的损伤有保护作用。本研究显示，MET及格列本脲药物干预8周后，尿白蛋白、GBMT、FRFP、足细胞病理形态学损伤较T2DM组均有所改善，且MET组优于GLY组，但MET组和GLY组两组间FBG和HbA1c值无统计学差异，提示MET可发挥独立于降糖作用的肾脏（包括肾小球足细胞）保护作用。进一步观察显示，T2DM组大鼠肾组织MIF、CD74 mRNA和蛋白表达升高，PCX表达降低，经MET、格列本脲干预后，模型大鼠肾组织MIF、CD74蛋白和mRNA表达均降低，PCX表达升高，且尿白蛋白及PCX排泄减少，且在血糖控制差异基本无差异时，MET组优于格列本脲，提示MET在相似降糖条件下能更有效地抑制T2DM大鼠肾组织MIF、CD74的上调及PCX的下调，该作用可能是MET保护肾脏损害的重要途径之一。目前的临床和实验性研究证实，MIF可激活局部肾小球足细胞表面CD74，导致细胞外信号调节激酶 1／2（ERK1／2）和 p38MAPK的磷酸化。MET可以缓解高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激和磷酸化的P38丝裂原活化蛋白酶（p-p38MAPK）蛋白表达。结合之前的研究，推测 MET干预后大鼠肾组织MIF、CD74的表达及尿MIF、CD74排泄的减少，可能通过抑制ERK1／2和p38MAPK途径的磷酸化，从而下调炎性相关细胞因子的表达（如TNF-α、MCP-1），进而对足细胞提供保护。