LncRNA H19调控Runx2表达对非创伤性股骨头坏死的影响*

宋 强，王振海，李敬武，穆胜凯

(1.沈阳市骨科医院研究所创伤科 110044；2.联勤部保障部队第967医院骨科，辽宁大连 116011；3.中国医科大学附属第一医院疼痛科，沈阳 110003；4.沈阳市骨科医院脊柱科 110044)

骨质破坏性疾病多由凝血和纤溶系统紊乱或血液供应不足引起，股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)作为其中之一的致残疾病，通常出现进行性的股骨头塌陷和继发性关节炎，对患者生存质量产生巨大影响，需行全髋关节置换术[1]。ONFH可分为创伤性和非创伤性(non-traumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH)两种亚型，NONFH常出现在30～50岁的患者，多出现在类固醇皮质激素治疗炎性疾病后[2]。有研究指出，NONFH同人类免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、酗酒、使用糖皮质激素及凝血障碍有关[3]。也有研究显示，间充质干细胞(MSCs)成骨分化能力的改变导致骨坏死和骨再生失衡，是NONFH发病的关键因素。各因素诱导MSCs向脂肪细胞分化，使细胞增殖和分化能力下降，导致机体自身修复能力降低，ONFH加重。但到目前为止，NONFH发病的具体分子机制仍不清楚[4]。

近年来，随着人类基因组计划的完成和高通量测序技术的进步，研究人员已逐渐将研究中心放在非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的生物学功能上。ncRNAs在调控基因表达中起着至关重要的作用[5]。其中，长度超过200个核苷酸的长链非编码RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)广泛参与生物体的生命过程，包括表观遗传学、转录和转录后调控等[6]。LncRNAs作为“脚手架”介导蛋白质间的相互作用[7-8]；作为“引导员”促进蛋白质和基因的启动子结合；作为“信号”调节邻近基因的转录；作为“诱饵”与微RNA(miRNA)或蛋白质竞争性结合，影响mRNA的转录[9]。但目前有关lncRNAs参与NONFH发生、发展的研究并不多见。Runt相关转录因子2(RUNX family transcription factor 2，Runx2)的表达是MSCs向成骨细胞谱系分化的充分且必要条件，是成骨细胞分化的标志[10]。Runx2高表达促进成骨细胞分化，而Runx2表达水平下调可能促进NONFH的进展[11-12]。因此，本研究分析NONFH患者lncRNA H19表达情况，并分析其可能的机制，为NONFH的诊断和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本采集

选取2014年1月至2018年12月在本院治疗的42例NONFH患者(NONFH组)，男25例，女17例；年龄30～69岁，平均(49.2±8.3)岁；病程1～11年，平均(5.7±2.5)年。同时选取年龄、性别分布相近的30名健康志愿者作为对照组，排除高血压、糖尿病、凝血和纤溶系统紊乱、心脑血管疾病及其他慢性疾病。对照组男17例，女13例；年龄28～72岁，平均(48.3±6.6)岁。本研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。入院当天所有受试者抽取全血20 mL，室温静置90 min，1 250×g室温离心20 min，制备血清标本。

1.1.2主要仪器与试剂

用于H19基因敲降的小干扰RNA(si-RNA)慢病毒、对照病毒及Runx2过表达质粒均购自上海吉凯基因化学技术公司。实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪购自瑞士Roche公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；鼠抗人Runx2抗体(1∶200)、兔抗人GAPDH抗体(1∶1 000)及二抗(1∶2 000)均购自美国Boster公司。人骨髓间充质干细胞(hMSC-BM)购自美国ScienCell研究实验室。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

hMSC-BM培养于含10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液(美国Invitrogen公司)的高糖DMEM培养基，37 ℃、50 mL/L CO2培养，当细胞生长至80%～90%时，收集、传代。对于成骨细胞分化实验，将培养基替换为含10%胎牛血清和100 ng/mL重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2，美国R&D Systems公司)的培养基，培养6 d。

1.2.2RT-PCR

TRIzol法提取总RNA，并检测纯度及浓度。依据日本TaKaRa公司试剂盒说明书进行逆转录和PCR反应。H19的上游引物序列为5′-GGT TGG AGT TGT GGA GAC-3′，下游引物序列为5′-GCG TAA TGG AAT GCT TGA A-3′；Runx2上游引物序列为5′-CGG CCC TCC CTG AAC TCT-3′，下游引物序列为5′-TGC CTG CCT GGG GTC TGT A-3′；U6的上游引物序列为5′-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3′，下游引物序列为5′-CAC TAT TGC GGG CTG C-3′。采用2-ΔΔCt法计算二者的相对表达水平。ΔCt=Ct标记物-CtU6。以U6作为内参进行相对定量，重复3次。

1.2.3细胞转染

Lipofectamine 2000将过表达和沉默载体转染进入细胞，转染48 h后，观察细胞生长情况，收集细胞用于进一步研究。Si-H19#1(5′-3′)：CCU CUA GCU UGG AAA UGA AUA(引导链)，UUC AUU UCC AAG CUA GAG GGU(过客链)；Si-H19#2(5′-3′)：GCA CUA CCU GAC UCA GGA AUC(引导链)，UUC CUG AGU CAG GUA GUG CAG(过客链)。

1.2.4Western blot

提取细胞总蛋白，制备8%聚丙烯酰胺凝胶，每孔20 μg上样；80 V积层胶，120 V分离胶进行电泳，100 V转聚偏氟乙烯(PVDF)膜90 min，5%牛血清蛋白(BSA)封闭PVDF膜1 h，加一抗，4 ℃振荡过夜。TBST洗涤后滴加二抗，37 ℃孵育1 h，显影成像。GAPDH作为内参，ImageJ软件获取灰度值。

1.2.5CCK-8增殖实验

细胞转染后24、48、72 h加入CCK-8试剂，37 ℃、5% CO2条件下培养2 h，多功能酶标仪测定450 nm处吸光度值(A450值)。每组设2个复孔，实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 NONFH患者及健康受试者血清lncRNA H19、Runx2表达情况

RT-PCR结果显示，lncRNA H19在NONFH患者血清中的表达水平为0.43±0.07，较lncRNA H19在健康受试者血清中表达水平(1.03±0.18)降低，差异有统计学意义(P<0.05，图1A)。而Runx2在NONFH患者血清中的表达水平为0.54±0.10，低于健康受试者血清中Runx2表达水平(1.05±0.13)，差异有统计学意义(P<0.05，图1B)。

A：血清lncRNA H19相对表达水平比较；B：血清Runx2相对表达水平比较；a:P<0.05,与对照组比较。

2.2 BMP-2促进lncRNA H19在hMSC-BM中表达

应用不同浓度的BMP-2诱导hMSC-BM的成骨分化，分别采用0、25、50、100、200 ng/mL BMP-2处理hMSC-BM，RT-PCR检测lncRNA H19表达水平变化，随着BMP-2加入量的增加，lncRNA H19的表达水平明显上升(P<0.05)，但在BMP-2加入至100 ng/mL后，lncRNA H19表达不再明显增加(P>0.05)，见图2。

a：P<0.05。

2.3 lncRNA H19表达对Runx2的影响

在hMSC-BM中分别过表达和沉默lncRNA H19，确定基因操作工具有效，其中si-H19#1具有更优的沉默效率(P<0.05，图3A)；采用RT-PCR和Western blot检测过表达或沉默lncRNA H19后Runx2表达水平的变化，结果显示lncRNA H19的表达变化并不引起Runx2 mRNA表达变化(P>0.05，图3B)，而对Runx2水平变化影响明显(P<0.05，图3C)。

A：转染si-H19和过表达质粒前后lncRNA H19表达情况；B：转染si-H19和过表达质粒前后Runx2 mRNA表达情况；C：转染si-H19#1和过表达质粒前后Runx2表达情况；NC：对照病毒质粒；a：P<0.05，与NC比较。

2.4 lncRNA H19和Runx2对hMSC-BM增殖能力的影响

CCK-8验证lncRNA H19和Runx2对hMSC-BM增殖能力的影响。将si-H19#1序列转染进入hMSC-BM后，细胞的增殖能力明显下降。在此基础上过表达Runx2，被抑制的细胞的增殖能力部分恢复(P<0.05)，见图4。

NC:对照病毒质粒；a:P<0.05，与si-H19#1比较。

3 讨 论

NONFH病因复杂，可由多种原因引起，对股骨头的损伤尤为突出，目前其病因和致病机制尚不清楚。日本第4次全国NONFH流行病学调查数据显示，致病因素中激素占50%，酒精占27%，酒精+激素性占2%，其他因素占21%[13]。目前针对NONFH早期患者以口服降脂药、抗凝药和双磷酸盐药物等为主，易引起胃肠道不适反应，并可能对肝、肾功能造成损伤，疗效欠佳[14]。对于中晚期患者多采取手术治疗，坏死晚期采用人工关节置换术，但手术存在费用高、创伤大、并发症多等缺点。因此，进一步探究NONFH的发生、发展机制，从分子水平探究其发病原因，给予针对性的靶向治疗，可能是临床治疗的突破口。

在过去的20年里，高通量测序技术的发展极大地加速了基因表达调控的相关研究。大量研究认为，ncRNA的表达改变是疾病发生的驱动因素之一[15-16]，广泛参与生物体的生命过程，如染色体重构、细胞分化及免疫应答等[17]。NONFH的发生需要ncRNA的参与。LI等[18]在1项糖皮质激素诱导的NONFH研究中发现了11个可能参与NONFH发生、发展的miRNAs，而WEI等[19]和CHEN等[20]分别发现了lncRNA HOTAIR和lncRNA AWPPH可能参与NONFH相关成骨基因的转录调控。本研究发现，lncRNA H19在NONFH患者血清中表达水平明显降低，可能参与NONFH的病理生理过程。lncRNA H19定位于人11p15.5，是第一个被证实为具有印记特性的基因[21]，在胚胎期表达，出生后表达下降，而往往在肿瘤及其他疾病中再次出现[22]。lncRNA H19过表达同血管生成和细胞增殖密切相关[21，23]。同时，过表达的lncRNA H19可以诱导卵巢癌细胞的上皮间质转化(EMT)，促进其侵袭转移[23]。有研究认为，lncRNA H19介导MSCs的多种分化过程，参与肌肉骨骼系统的再生，并对骨代谢过程进行调控[24]。

骨的形成主要是由骨祖细胞、软骨祖细胞及细胞外基质协同作用完成，而细胞增殖分化、细胞外基质成熟、矿化和细胞凋亡是成骨细胞在骨形成中的4个主要阶段。成骨细胞分化改变是NONFH发生、发展过程中的关键病理变化[11]，而BMP-2能够诱导成骨细胞分化[25]。本研究发现，lncRNA H19在hMSC-BM中的表达水平同BMP-2加入剂量相关，BMP-2以浓度依赖的方式促进lncRNA H19在hMSC-BM中的表达，提示lncRNA H19参与了成骨细胞分化的调控。本研究结果显示，lncRNA H19和Runx2在NONFH患者血清中均表达降低；而在hMSC-BM中过表达lncRNA H19后能够在转录后水平促进Runx2的表达；相反，在抑制了lncRNA H19的表达后Runx2的表达也随之降低。而在细胞增殖的回补实验中发现，抑制lncRNA H19后细胞的增殖能力减弱，而过表达Runx2后，细胞的增殖能力部分恢复，提示lncRNA H19对细胞增殖能力的影响是通过Runx2实现的。

综上所述，与健康对照相比，NONFH患者lncRNA H19表达下调。lncRNA H19能够促进hMSC-BM中Runx2表达，并诱导细胞增殖。因此，lncRNA H19可能通过影响Runx2表达参与NONFH的发生、发展，但二者之间调控的具体机制仍需进一步探讨。此外，血管内凝血学说认为各种系统疾病激活的血管内凝血也可能是引起骨内血栓和骨坏死的重要途径，NONFH患者往往存在血小板活性程度增高、凝血趋势增加的高凝和低纤容状态。lncRNA H19和Runx2在这其中扮演的角色仍不明确，这也是后期基础向临床转化的一个重要讨论方向。