山西老陈醋源凝结芽孢杆菌VP4细菌素在冷鲜羊肉保藏中的应用

许 女，杨 光，王 璐，张 浩，王如福

（山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801）

羊肉具有比其它畜肉更高的营养价值，我国是生产羊肉的第一大国，尤其是山西塞外地区的怀仁、右玉及内蒙地区，其得天独厚的自然条件成为生产优质羊肉的重要基地。我国生产的羊肉基本以内销为主，冷冻肉占到产品的95%以上。冷鲜肉的生产非常少，而冷鲜肉具有冷冻肉所不能比拟的优势。纵观国际市场，发达国家的羊肉生产过程中广泛应用全程标准化技术、保鲜技术以及高新食品工程技术，从而提高了其市场竞争能力。尤其是在澳大利亚和新西兰等羊肉出口大国，由于保鲜技术先进，使羊肉在非冷冻条件下的保质期达21 d 以上，因此远销世界各地[1]。解决冷鲜肉的保藏问题，即打破了限制冷鲜羊肉推广和出口的瓶颈。

与化学保鲜剂相比，生物保鲜剂具有高效、安全等优点，主要为植物源、动物源和微生物源。植物源保鲜剂主要是香辛料（生姜、大蒜、迷迭香等）、中草药（当归、连翘等）及茶叶（茶多酚）等提取物；动物源保鲜剂主要指壳聚糖、抑菌蛋白和抑菌肽。目前最具有开发前景的是微生物源保鲜剂，微生物的代谢物质如：酸、细菌素、过氧化氢、诱导酶及溶菌酶等都具有抑菌和杀菌活性，很多已成功地用于商业开发，如乳酸链球菌素Nisin 等。涉及的微生物菌种主要包括两大类：（1） 乳酸菌：植物乳杆菌、乳酸乳球菌、双歧杆菌、戊糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、弯曲乳杆菌、乳酸片球菌、短乳杆菌、粪肠球菌等；（2）芽孢菌：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。Chaillou 等[2]研究了几种清酒乳杆菌的混合菌种对牛肉的保鲜作用，荧光定量PCR 结果显示，清酒乳杆菌显著抑制了真空和气调包装牛肉糜中大肠杆菌和沙门氏菌的生长，延长了其货架期。Miao 等[3]证明1.2%的副干酪乳杆菌FX-6 抑菌液，可使冷鲜猪肉的货架期延长到12 d。云美林[4]采用清酒乳杆菌、植物乳杆菌与海藻酸钠混合制成的生物抑菌涂膜法，在4 ℃条件下，将冷鲜羊肉的保质期延长至12～16 d。

本文自山西老陈醋醋醅中分离1 株凝结芽孢杆菌VP4，研究产生细菌素的pH 值、热稳定性及在冷鲜羊肉保藏中的作用，为天然生物保鲜剂的开发提供数据支持，对指导冷鲜肉的标准化生产，提高其保质期、安全性等具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸菌菌株，山西农业大学食品科学与工程学院生物工程实验室保存。

MRS（乳酸菌培养、计数）、NA（芽孢菌培养）、BHI（病原菌培养）、PCA（菌落总数计数）、GSP（假单胞菌选择性计数）、VRB（肠杆菌选择性计数）培养基，北京陆桥技术有限责任公司；细菌提基因组试剂盒，北京博迈德科技发展有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）反应缓冲液、10×Loading Buffer，大连宝生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

Veriti PCR 扩增仪，美国ABI 公司；电泳成套设备，美国Bio-rad 公司；凝胶成像系统，美国Alpha Innotech 公司；台式高速冷冻离心机，美国Sigma 公司；电导仪，梅特勒-托利多仪器有限公司；色差仪，日本柯尼卡美能达CR-400。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌菌株的抑菌活性测定 乳酸菌发酵上清液的制备：乳酸菌菌种经MRS 培养基活化后，37 ℃静置培养24 h，8 000 r/min 离心15 min，收集上清液，4 ℃冰箱保存备用。

抑菌试验：将指示菌按2%的接种量接种于BHI 液体培养基中，37 ℃，150 r/min 摇床过夜，稀释到107CFU/mL 备用。吸取150 μL 指示菌（107CFU/mL） 涂布于LB 琼脂平板上，常温干燥30 min。将200 μL 上述菌株发酵上清液加入牛津杯内，4 ℃冰箱中静置4 h 后，置于37 ℃培养箱培养24 h，测定抑菌圈直径（d）。

1.3.2 乳酸菌菌株的鉴定及系统发育树构建 对抑菌活性强的菌株进行16S rDNA 测序，并绘制系统进化树。

1.3.3 凝结芽孢杆菌VP4 所产抑菌物质的初步鉴定 按照文献[5]的方法对发酵上清液进行有机酸、过氧化氢的排除试验，并研究蛋白酶对上清液抑菌活性的影响。

1.3.4 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素的pH 值和热稳定性测定 热稳定性试验：将发酵上清液分别在60，100，121 ℃下处理30，60 min，测定其抑菌活性。

酸碱稳定性试验：分别用浓度为1.0 mol/L 的HCl，NaOH 溶液，将发酵上清液的pH 值调至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，于30 ℃下处理1 h，然后将pH 值调回至中性，测定其抑菌活性。

1.3.5 扫描电镜试验 将凝结芽孢杆菌VP4 发酵上清液调至中性，浓缩5 倍后，按10%（体积分数）的添加量，分别加入到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的悬液中（106CFU/mL），37 ℃，160 r/min 振荡培养24 h，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集菌体细胞，空白对照组加入10%的空白NA 培养基上清液。按照文献[6]的方法，固定，漂洗，脱水，干燥，镀膜，扫描电镜观察。

1.3.6 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素在冷鲜羊肉保藏中的应用

1.3.6.1 VP4 细菌素处理液的制备 凝结芽孢杆菌VP4 按3%的接种量接种于NA 培养基中，160 r/min，37 ℃培养24 h，8 000 r/min 离心15 min，收集上清液，调pH 值为中性后，80%的硫酸铵沉淀过夜，透析，真空冷冻干燥制成粉，用无菌水配制成质量浓度6 g/100 mL 和8 g/100 mL，备用。

1.3.6.2 冷鲜羊肉的处理 取羊后腿肉切成质量约80 g 的小块分成3 组，分别是对照组、6%VP4细菌素处理组和8%VP4 细菌素处理组，每组10块。经紫外照射10 min，每组肉块在对应的处理液中浸渍1 min 后取出（对照组的处理液为无菌水），摆于无菌盘筛中，置于超净台中无菌风吹10 min 至表面溶液稍干，保鲜膜托盘包装，放入（4±1）℃的冰箱中贮藏。每隔3 d 抽样，测定pH 值、电导率、TVB-N、TBA、色差值、微生物指标及感官评价。

1.3.6.3 理化及微生物指标的测定

1） 微生物指标的测定 总菌数、乳酸菌、假单胞菌、肠杆菌分别采用PCA、MRS、GSP 和VRB培养基测定。

2） 理化指标的测定 按照文献[7]的方法测定冷鲜羊肉的pH 值、电导率、挥发性盐基氮（TVB-N）和硫代巴比妥酸（TBA）值。采用TCP2 型全自动色差计测定冷鲜羊肉的肉色。用亨特系统表示，以标准白板为标准，以标准样品为对照，测定肉样表面的L 值和a 值。

2 结果与分析

2.1 具有抑菌活性乳酸菌菌株的筛选、鉴定

按照1.3.1 中的方法，考察分离自醋醅、泡菜、传统乳制品和青贮饲料中的10 株乳酸菌对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力，试验结果如表1所示。菌株EL172，SK2，VP4 的抑菌活性最强，经16S rDNA 测序分别鉴定为发酵乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌，并构建系统进化树，见图1。

表1 具有抑菌活性乳酸菌的筛选Table 1 Antibacterial activity of LAB candidate strains

图1 基于16S rDNA 序列的乳酸菌进化树Fig.1 Dendrogram of LAB isolates based on 16S rDNA sequence

2.2 乳酸菌菌株抑菌物质的初步鉴定

乳酸菌在代谢过程中产生的二氧化碳、有机酸、过氧化氢和细菌素等物质都具有抑菌活性。表2结果显示，用NaOH 调节pH 值为7.0 的EL172和VP4 菌株发酵上清液的抑菌圈直径虽略有减小，但变化不大，仍具有很强的抑菌活性。而SK2菌株的发酵上清液调pH 值为7.0 时抑菌活性丧失，表明其产生抑菌活性的主要物质是代谢产物中的酸类。

经过氧化氢酶处理后，EL172 和VP4 菌株的抑菌效果未见明显变化，故排除过氧化氢所起的抑菌作用。被蛋白酶K 和胰蛋白酶作用后抑菌圈消失，说明这2 株菌产生的抑菌物质对蛋白酶K、胰蛋白酶敏感，可初步确定是蛋白质类物质，为细菌素类。据报道，几乎所有的细菌都能产生至少1种细菌素或细菌素类似物，这是细菌存在的自我防御机制。对细菌素产生菌的研究大都集中在乳酸菌和芽孢菌中，然而鲜有关于凝结芽孢杆菌细菌素的报道。赵钰[8]分离了1 株具有抑菌活性的凝结芽孢杆菌LL1103，证明胞外抑菌物质为细菌素类物质乳杆菌素（lactocin）。凝结芽孢杆菌又称乳酸芽孢杆菌，同型发酵产生乳酸，被美国药品食品监督管理局（FDA）认定为安全有效的益生菌。本文从醋醅中分离出1 株具有强抑菌活性的凝结芽孢杆菌，并且证明抑菌活性成分为细菌素类物质，具有良好的开发应用前景。

表2 不同处理对凝结芽孢杆菌VP4 发酵上清液抑菌作用的影响Table 2 The effect of different treatment on antimicrobial activity of fermented supernatant of Bacillus coagulans VP4

2.3 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素的pH 值及热稳定性

将发酵上清液在不同温度下处理不同时间，结果见表3。60 ℃处理60 min，活性无明显变化；100 ℃处理60 min，抑菌活性略有降低〔抑菌圈直径为（25.16±0.28）mm〕。随着温度升高，VP4 细菌素的抑菌活性显著降低；121 ℃处理60 min 后，抑菌圈直径为20 mm，证明VP4 细菌素热稳定性良好，可以耐受食品加工中最常见的巴氏杀菌操作（65～80 ℃加热15 min），甚至在更高的灭菌温度下（121 ℃，20 min）仍具有较高的活性，大大扩展了其应用范围。

将发酵上清液调至不同pH 值，30 ℃孵育1 h后，检测其抑菌活性，结果如表4所示。由表4可知，该抑菌物质在pH 2～10 范围内抑菌效果稳定；在pH 4.0 时，抑菌圈直径最大为（30.85±0.41）mm；当pH 值达到12 时，抑菌活性显著下降。赵钰[8]报道的凝结芽孢杆菌产生的细菌素Lactocin LL1103，在pH 6.0 时具有最强的抑菌活性。而郭颖等[9]、张百刚等[10]报道的植物乳杆菌NDC75017细菌素、乳酸乳球菌细菌素Nisin，及大部分嗜酸乳杆菌产生的细菌素在pH 值为6 时，抑菌活性已完全丧失。李琳等[11]则发现嗜热链球菌素ST9在pH 2.0～9.0 之间均有活性，还有一些细菌素只在碱性条件下才具有抑菌效果。可见，菌种不同，细菌素发挥抑菌活性的最适pH 值不同，可能是由于pH 值的改变，影响到细菌素所带的电荷或改变膜的组成，从而影响细菌素和靶细胞膜间的作用力[12]。

2.4 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素抑菌试验的扫描电镜观察

由图2可知，未经处理的大肠杆菌形态规则完整，而经浓缩5 倍的凝结芽孢杆菌VP4 发酵上清液处理24 h 的大肠杆菌菌体严重皱缩，内容物泄露，菌体断裂现象严重。未经处理的金黄色葡萄球菌形态规则完整，表面较光滑，外观饱满，而经浓缩5 倍的凝结芽孢杆菌VP4 发酵上清液处理24 h 的金黄色葡萄球菌菌体表面有明显的凹陷、皱缩、内容物流出，粘连现象严重。

表3 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素的热稳定性Table 3 Heat stability of bacteriocin produced by Bacillus coagulans VP4

表4 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素的pH 稳定性Table 4 pH stability of bacteriocin produced by Bacillus coagulans VP4

2.5 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素在冷鲜羊肉保藏中的应用

2.5.1 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素对冷鲜羊肉中微生物的影响 微生物在冷却肉上繁殖，产生的代谢产物使肉呈腐败气味，这些异味物质包括酯、含硫化合物（硫化氢、甲硫醚、甲硫醚的氧化产物等）、酮、支链醇、不饱和烃、氨或胺等是冷鲜肉腐败变质的主要原因[13]。周琰冰等[14]和孙丹丹等[15]采用传统菌种分离手段结合PCR-DGGE 技术证明假单胞菌、嗜酸乳杆菌、清酒乳杆菌等乳酸菌、肠杆菌和其它一些嗜冷菌是4 ℃冷藏期间羊肉中的优势菌。

按照国标GB/T 22289-2008[16]要求，新鲜肉的菌落总数＜4 lg（CFU/g）；次鲜肉为4～6 lg（CFU/g）；变质肉为超过6 lg（CFU/g）。由图3可知，本试验选取的羊肉都为新鲜羊肉，从0 d 开始，细菌总数持续上升，对照组从第2 天开始，菌落总数就超过了4 lg（CFU/g），而添加了VP4 细菌素的处理组羊肉中的细菌显著受到抑制，并与剂量呈正相关，添加了8%VP4 细菌素的处理组在第7 天的细菌总数仍低于4 lg（CFU/g），在第15 天为5.12 lg（CFU/g），属于次鲜肉。

肠杆菌属于兼性厌氧菌，在有氧的环境下会分解葡萄糖，产生硫化物和胺类等有异味物质，在无氧条件下会产生硫化氢。图4结果显示，添加了VP4 细菌素的处理组羊肉中的肠杆菌显著受到抑制，4 ℃冷藏15 d 时，对照组、6%和8%VP4 细菌素处理组的肠杆菌数分别为7.98，6.82，5.02 lg（CFU/g）。

图2 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素抑菌的电镜试验Fig.2 SEM survey of antimicrobial activity of bacteriocin produced by Bacillus coagulans VP4

图3 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中菌落总数的变化情况Fig.3 Changes of total viable counts in mutton samples during storage at 4 ℃

图4 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中肠杆菌的变化情况Fig.4 Changes of Enterobacteria populations in mutton samples during storage at 4 ℃

乳酸菌为革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧，是肉品中主要的腐败菌。乳酸菌能够利用葡萄糖产生乳酸，当碳水化合物耗尽，就开始利用氨基酸产生挥发性脂肪酸，使肉品出现腐败气味，并且生长速度会超过肠杆菌等其它腐败菌，最终成为优势菌。在整个冷藏期间，乳酸菌的数量不断上升，与对照组相比，添加6%VP4 细菌素处理组的冷鲜羊肉中的乳酸菌的数量下降了将近2 个数量级，并且6%和8%处理组之间没有显著差异。

假单胞菌为嗜冷菌，是低温条件下肉品中的优势菌，其增殖速度快。在有氧环境下，假单胞菌会利用葡萄糖生长繁殖；当葡萄糖不再充足时，假单胞菌转而利用氨基酸，会生成有异味物质，如含硫化合物、氨、酯和酸类等腐败产物。肉及肉制品、鲜鱼贝类等食品被假单胞菌污染后会导致肉表面形成黏液，产生难闻的气味，肉色变绿。本文采用8%VP4 细菌素的处理组在4 ℃冷藏15 d 时，假单胞菌的数量被控制在5 lg（CFU/g）以下，而对照组则上升到7.58 lg（CFU/g）。

图5 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中乳酸菌的变化情况Fig.5 Changes of lactic acid bacteria populations in mutton samples during storage at 4 ℃

图6 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中假单胞菌的变化情况Fig.6 Changes in Pseudomonas populations in mutton samples during storage at 4 ℃

2.5.2 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素对冷鲜羊肉理化指标的影响 由于pH 值对酶的活性有一定影响，因此会影响酶催化降解产生核苷酸、游离氨基酸和小肽等风味物质，进而影响肉的风味。为了防止这种情况发生，可以通过检测pH 值控制肉的品质，从而降低经济损失[17]。一级鲜肉的pH 值指标是5.9～6.5，次鲜肉的pH 值是6.6～6.7，腐败变质肉的pH＞6.7。如图7所示，随着贮藏时间的延长，样品中的pH 值呈逐渐升高趋势，到第15 天时，对照组、6%和8%VP4 细菌素处理组的pH 值分别为7.51，6.25 和6.03，表明VP4 细菌素有效地抑制了冷藏肉中微生物的生长，pH 值的升高主要是由于肉中的蛋白质被分解成碱性的胺及胺类物质，pH值越大，表明肉的腐败程度越高。

15 d 内，加入6%、8%VP4 细菌素的4 ℃保藏肉的电导率的变化规律如图8所示。在细菌素的作用下，样品中的微生物细胞降解破碎，细胞内容物溢出，溶液中的离子增多，使电导率增大。

图7 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中pH 的变化情况Fig.7 Changes in pH value of mutton samples during storage at 4 ℃

图8 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中电导率的变化情况Fig.8 Changes in electric conductivity of mutton samples during storage at 4 ℃

TVB-N 值，即挥发性盐基氮的含量，表示样品中蛋白质降解程度，是评价肉的新鲜程度的重要指标，国标GB/T 22289-2008[16]要求肉及肉制品中挥发性盐基氮含量达15 mg/100 g 时，说明肉已经变质腐败。TVB-N 是贮藏期间，肉经微生物或酶分解作用产生，主要包括氨、三甲胺（TMA）和二甲胺（DMA）等。羊肉在4 ℃冷藏期间的TVB-N 值变化如图9所示，对照组中的TVB-N 值在第3 天时达到15.22 mg/100 g，已经超过国标限量值，而添加了VP4 细菌素的处理组在第10 天时，TVBN 值还未超过国标限量值，大大延长了冷鲜羊肉的保藏期。

TBA 指标表明肉的脂肪氧化程度，很多研究结果表明，TBA 值的大小与肉品脂肪的氧化程度及感官评价之间有很强的相关性。在国外，TBA 值常用于生肉鲜度的测定，当TBA 值大于0.5 mg/kg时，表明氧化正在进行。通常新鲜肉制品的最大TBA 值为0.71～1 mg/kg，超过即认为是产生氧化酸败，不能食用。试验结果表明，添加VP4 细菌素的处理组在整个检测期（15 d） 都未超出这个范围，显著抑制了肉的脂肪氧化酸败；第15 天时，对照组、6%和8%VP4 细菌素处理组的TBA 值分别为1.85，0.91，0.71 mg/kg。

图9 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中TVB-N 的变化情况Fig.9 Changes in TVB-N of mutton samples during storage at 4 ℃

图10 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中TBA 的变化情况Fig.10 Changes in TBA of mutton samples during storage at 4 ℃

肉品色泽是影响其销售量的一个重要因素。肌肉自身的生理、生化以及微生物因素会影响肉品色泽，其中肌肉中肌红蛋白和血红蛋白的含量起到至关重要的作用，充分放血后肌红蛋白对肉色起决定性作用，当肉品中的肌红蛋白被氧化后，会形成使肉色变暗的高铁肌红蛋白，降低肉的品质[18]。色差L 值表示肉样的明暗程度，数值越大，表明肉色越亮。由图11可知，在4 ℃冷藏6 d 以内，L 值变化不明显；之后，对照组的L 值逐渐降低，而VP4 细菌素处理组减缓了L 值的下降，然而不同处理浓度组之间无显著差异。云美林[4]利用生物抑菌涂膜法保藏冷鲜羊肉，结果发现，随着贮藏时间的延长，处理组和对照组的L 值都呈降低趋势。张黎利[19]采用植物精油抗菌包装延长冷鲜猪肉保藏期的研究发现，贮藏后期，肉的L 值下降，颜色较浅，缺乏光泽。Luo 等[20]利用分离自干火腿中的1 株唾液乳杆菌H（Lactobacillus salivarius H）对冷鲜猪肉色泽影响的研究报道也证实了这一点。

图11 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中L 值的变化情况Fig.11 Changes in L value of mutton samples during storage at 4 ℃

图12 冷鲜羊肉4 ℃贮藏过程中a 值的变化情况Fig.12 Changes in a value of mutton samples during storage at 4 ℃

肉样表面色差指标中，a 值表示红度，a 值越大表明肉样颜色越红。由图12可知，a 值在0 d时最高，表明刚开始时羊肉色泽最红，最鲜艳。之后，3 组a 值均随贮藏时间的延长而下降，与贺红军[21]、云美林[4]的结论类似。对照组和VP4 细菌素组在贮藏期间差异显著，表明VP4 细菌素组对羊肉色泽的保持效果较好，红度保持较稳定。

2.5.3 凝结芽孢杆菌VP4 细菌素对冷鲜羊肉感官评价的影响 感官评价测定过程中，首先观察肉制品的颜色是否均匀，贮藏期间肉品颜色由鲜红逐渐变成暗红，最后变成暗褐色；检查切割处的颜色与光泽是否鲜艳，有无淤血、囊肿以及污染，还应检查肉边是否有碎肉、碎骨等；之后闻其气味是否新鲜，有无令人不愉悦的腥臭味；最后用手指按压，接触肉制品，判断是否具有弹性或者发黏，做出综合评价[16]。本文参考文献[3]的方法，采用定量描述分析，对VP4 细菌素处理组和对照组中羊肉的色泽、质地、气味、黏性和汁液流失率5 项评价指标（每项指标评分为1～5 分，总分25 分）进行感官分析，结果如图13所示。VP4 细菌素处理组的感官评价明显优于对照组，表明凝结芽孢杆菌VP4 细菌素可以延长冷藏羊肉的货架期，提高产品品质和安全性，具有优良的开发应用潜力。

图13 冷鲜猪肉4 ℃贮藏过程中的感官评价Fig.13 Sensory evaluation of mutton samples during storage at 4 ℃

3 结论

乳酸菌以其天然、强抗菌性及安全可靠等优势，逐步成为取代传统食品保鲜技术的关键技术之一。本文从山西老陈醋醋醅中筛选出1 株具有强抑菌活性的凝结芽孢杆菌VP4，该菌产生的细菌素的pH 值和热稳定性较好。将VP4 细菌素应用在冷鲜羊肉的保藏中，其抑菌效果明显，显示其作为生物保鲜剂在冷鲜肉保藏中的应用潜力，为研究开发新型食品保鲜技术提供依据。