预电针调节胆碱能神经相关蛋白对AD样大鼠学习记忆能力及脑内炎症的影响

黄重生 何川 陈虹茹 余超超 王雪松 姜韬 卢威 孔立红

(湖北中医药大学针灸骨伤学院 针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430061)

阿尔茨海默病(AD)是中枢神经系统(CNS)退行性疾病，以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床特征〔1〕。到 2050年全球AD患者数量预计将达到1.315亿〔2〕，而全球经济成本预计将达到59.14万亿元人民币(9.12万亿美元)〔3〕，给世界带来沉重的社会和经济负担。临床上对AD的治疗主要采用乙酰胆碱酯酶抑制和天冬氨酸受体抑制剂，但效果有限，只能适当改善临床症状〔4〕，且由于AD神经元病理损伤的不可逆性，其病程往往难以逆转〔1〕，因此研究AD早期防治策略具有重要的临床意义。慢性脑内炎症在AD病程中起关键作用，炎症反应产生的氧化自由基和其他神经毒性物质会破坏神经细胞的结构，炎症因子则会加速神经元的凋亡，因此对于AD的预防和治疗，脑内炎症是重要靶点〔5〕。胆碱乙酰转移酶(ChAT)、α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)是胆碱能神经系统的重要蛋白，参与胆碱能抗炎通路(CAP)，在炎症反应中起重要作用〔6〕，激活α7nAChR可降低肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β、IL-6的释放，减轻炎症反应〔7〕，促进AD空间、位置及长、短期记忆的恢复〔8〕。以往的临床研究也表明电针在AD的临床防治中能起到重要作用〔9～12〕。因此本研究以AD脑内炎症为靶点，以针灸“治未病”理论为指导，探讨预电针对胆碱能相关蛋白的调控及对AD学习记忆能力障碍和脑内炎症的防治作用，以期为推广针灸“治未病”防治AD 提供依据。

1 材料及方法

1.1实验动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠40只，体重(350±20)g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。大鼠饲养于湖北中医药大学针灸研究所，分笼饲养，自由摄食、饮水，动物房室温(25±2)℃，湿度(45±10)%。适应性喂养1 w后通过Morris水迷宫实验剔除学习记忆异常的大鼠，剩30只，将大鼠随机分为正常组、模型组、预电针组，每组10只。

1.2主要仪器和试剂 中研太和牌一次性无菌针灸针(天津亿朋医疗器械有限公司)、HANS-200A韩式电针仪(南京济生医疗科技有限公司)、Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)、KL-Ⅰ型生物组织自动包埋机(湖北康龙电子科技有限公司)、Finesse325旋转石蜡切片机(英国珊顿公司)、共聚焦显微镜(德国徕卡显微系统公司，仪器型号TCS SP8)。α7nAChR抗体(英国Abcam)，离子钙接头蛋白(Iba)-1抗体(英国Abcam)，ChAT抗体(美国Proteintech Group)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液(上海碧云天生物技术有限公司)，TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司)，免疫组化试剂盒(中杉金桥公司)。

1.3造模方法 采用腹腔注射D-半乳糖溶液制备AD样大鼠模型。每组大鼠每周按时称重，记录体重，按照150 mg/kg配制注射液，根据大鼠体重计算出每次注射量，模型组与预电针组每天连续腹腔注射D-半乳糖溶液，正常组每天注射生理盐水，持续8 w〔13，14〕。

1.4电针干预方法 每日造模完成后，对预电针组大鼠进行电针治疗，治疗取临床治疗AD的常用穴百会穴、足三里穴〔15〕，参照《实验针灸学》〔16〕进行选穴定位。百会穴位于顶骨正中，足三里穴位于膝关节后外侧，在腓骨头下5 mm处。针刺选用0.25 mm×13.00 mm一次性无菌针灸针，百会穴向前斜刺2 mm，足三里穴直刺7 mm，针刺后连接上HANS-200A 电针仪，电极分别接百会穴和足三里穴，单日接左侧足三里穴，双日接右侧足三里穴，左右侧足三里穴交替使用。选用电流为1 mA，频率为50 Hz的连续波，以大鼠肢体颤动、无嘶叫声为佳，每日治疗1次，每次治疗20 min，连续治疗6 w，正常组常规饲养，模型组同步抓取固定20 min〔17，18〕。

1.5观察指标及检测方法

1.5.1Morris水迷宫实验检测大鼠行为学 水迷宫装置周围避光，水温保持(25±2)℃。(1)定位航行实验：于治疗结束第2天开始，平台位于第4象限正中，距水面2 cm，将大鼠依次从四个象限之一面向池壁放入水中，记录其找到平台的时间，即为其逃避潜伏期。若大鼠在120 s内找到平台，则可停留休息15 s，若未找到，则由实验人员将其引上平台，同样停留15 s，记录其逃避潜伏期为120 s。每个象限完成后休息1 min，再进行下一个象限，实验持续5 d。(2)空间探索实验：第6天撤除平台进行空间探索实验，在四个象限中任选1个作为入水点，将大鼠面向池壁放入水池中，记录大鼠120 s内的游泳路径及其在原平台象限的停留时间和穿越原平台区域的次数。

1.5.2免疫组织化学法检测海马CA3区ChAT阳性细胞的表达 水迷宫实验结束后，各组大鼠用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉(3 ml/kg)，每组取5只大鼠灌注固定后取脑。石蜡包埋切片。常规脱蜡后进行微波加热抗原修复，自然冷却，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，封闭，孵育，滴加ChAT一抗，4℃过夜，滴加生物素标记山羊抗兔IgG，孵育1 h，滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，孵育，二氨基联苯胺(DAB)染色，滴加苏木素复染，1% HCl溶液分化，脱水，封片，拍照，用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析。

1.5.3免疫荧光法检测海马CA3区小胶质细胞的阳性表达 常规脱蜡后进行微波加热抗原修复，常温冷却，山羊血清封闭，滴加Iba-1抗体(1∶100)，4℃过夜，滴加Cy3二抗，孵育，滴加DAPI，PBST冲洗，封片，在共聚焦显微镜下采集图像。

1.5.4Western印迹法检测大鼠海马组织α7 nAChR、Iba-1蛋白表达水平 每组取5只大鼠断头取脑，取新鲜海马保存。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗组织，离心管中振荡冰浴后收集上清液，用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测蛋白浓度，以每个孔40 μg蛋白为标准进行上样，按浓缩胶80 V、分离胶120 V进行恒压电泳。300 mA恒流转膜，封闭1 h，加一抗4℃过夜，TBST清洗，加二抗，室温孵育2 h，TBST摇床上清洗。滴加电化学发光(ECL)混合溶液，曝光，用Image-Pro Plus6.0分析目标条带的灰度值，以目标带的吸光度值与内参β-actin吸光度值之比作为α7nAChR、Iba-1的相对表达量。

1.5.5ELISA检测大鼠海马IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度 用96孔的ELISA试剂盒分别检测IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度，实验步骤参照试剂盒说明书。

1.6统计学处理 采用SPSS23.0软件进行双因素方差分析、单因素方差分析、Bonferroni法。

2 结 果

2.1各组行为学比较 纳入大鼠均正常完成实验，无脱落及死亡。与正常组比较，模型组大鼠水迷宫逃避潜伏期显著更长(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，预电针组大鼠水迷宫逃避潜伏期显著更短(P<0.05,P<0.01)。见表1。与正常组比较，模型组大鼠在原平台象限停留时间显著更短(P<0.05)，穿过原平台所在位置的次数显著更少(P<0.01)；与模型组比较，预电针组大鼠在原平台象限停留时间显著更长(P<0.01)，穿过原平台所在位置的次数显著更多(P<0.05)。见表2。

表1 各组水迷宫逃避潜伏期

表2 各组原平台象限停留时间和穿过原平台位置次数

2.2各组海马区炎症因子的含量的比较 与正常组比较，模型组大鼠海马区炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达显著增多(P<0.01)；与模型组比较，预电针组大鼠海马区炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达显著减少(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3 各组海马区IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度比较

2.3各组海马区α7nAChR、Iba-1蛋白表达的比较 与正常组比较，模型组大鼠海马区α7nAChR蛋白表达显著减少(P<0.01)，Iba-1蛋白表达显著增多(P<0.01)；与模型组比较，预电针组大鼠海马区α7 nAChR蛋白表达显著增多(P<0.05)，Iba-1蛋白表达显著减少(P<0.05)。见图1、表4。

图1 各组海马区α7nAChR、Iba-1蛋白表达

表4 各组海马区α7nAChR、Iba-1蛋白相对表达量的比较

2.4各组海马CA3区ChAT阳性细胞表达的比较 与正常组比较，模型组大鼠海马CA3区ChAT阳性细胞表达更少，平均光密度值更低(0.017±0.001 vs 0.013±0.001；P<0.01,n=5)；与模型组比较，预电针组大鼠海马CA3区ChAT阳性细胞表达更多，平均光密度值(0.015±0.001)更高(P<0.01，n=5)。见图2。

图2 各组海马CA3区ChAT阳性细胞表达的比较(DAB，×400)

2.5各组海马CA3区小胶质细胞活化的比较 与正常组比较，模型组大鼠海马CA3区活化的小胶质细胞数量增多，荧光强度升高(1.449±0.090 vs 2.207±0.161；P<0.01)；与模型组比较，预电针组大鼠海马CA3区活化的小胶质细胞数量减少，平均荧光强度(1.806±0.073)降低(P<0.05)。见图3。

3 讨 论

在中医学上AD属痴呆范畴，病机为髓海不足，痰瘀阻窍，治疗多采用固本培元、开窍醒脑的方法〔19〕。AD被划分为临床前期、轻度认知障碍期、痴呆期，而在临床前期患者大脑、脑脊液和血液等方面已有可测量性变化〔1〕。因此，以中医治未病思想为指导，研究预电针对AD的早期干预作用具有重要的临床意义。临床在AD的治疗上百会穴和足三里穴使用频率较高〔15〕，百会穴有通督调神、益精填髓、开窍醒脑之功〔20〕，足三里穴有补益气血、固本培元、强精健脑之效〔21〕，两穴合用，标本兼治。

20世纪90年代有文献报道患有类风湿性关节炎的病人患AD的概率降低，其原因在于患者长期服用非甾体抗炎药〔22〕。随后研究证实AD病程中存在脑内慢性炎症反应，大量活化的小胶质细胞和T细胞释放自由基和神经毒性物质及多种炎症因子，对神经组织造成持续损伤〔5〕，同时聚集的Aβ蛋白会进一步激活炎症反应，促使膜攻击复合体(MAC)直接裂解神经元〔23〕，所以对脑内炎症的治疗是AD治疗的重要靶向之一〔24，25〕。

CAP是指CNS接收迷走神经传入支传入的信号，调节迷走神经末梢释放乙酰胆碱(Ach)，与巨噬细胞表达的α7nAchR相结合，激活酪氨酸激酶(JAK)2/信号转导和转录激活因子(STAT)3及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子(NF)-κΒ等信号通路，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的释放从而发挥抗炎作用的通路〔6〕。ChAT是Ach合成的核心蛋白酶，其含量反映了Ach合成量〔26〕。小胶质细胞是CNS的巨噬细胞，当其活化时会释放大量自由基、神经毒素和炎症因子，导致炎症反应和神经细胞损伤〔27〕，其活化的特异性标志物是Iba-1蛋白〔28〕，其表达量反映了小胶质细胞的活化程度。研究证明针刺可激活胆碱能抗炎通路，显著减少TNF-α和IL-1β等炎症因子的释放，减轻炎症反应〔29，30〕。

本研究采用D-半乳糖腹腔注射诱导的AD大鼠模型，来模拟AD患者大脑记忆障碍及炎症表现和海马神经损害。腹腔注射D-半乳糖会导致大鼠脑组织活性氧(ROS)增高、氧化应激、神经炎症和神经退行性改变，导致神经突触功能障碍及老年斑、脂褐素等病理产物的沉积，这与AD的病理特征在一定程度上相吻合〔31，32〕。长期进行D-半乳糖注射会诱导NF-κB信号通路的激活和炎症反应，激活神经小胶质细胞，导致大鼠海马TNF-α、IL-1β等炎症因子的上调，加重炎症损伤〔32，33〕。

本实验结果表明预电针百会穴、足三里穴能上调胆碱能神经相关蛋白ChAT、α7nAChR的表达，抑制AD样大鼠海马区小胶质细胞的活化，减少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的分泌，改善大鼠学习记忆能力。这些结果与针灸对胆碱能抗炎通路的激活十分相似，表明胆碱能抗炎通路可能参与预电针的抗炎效应，其机制有待进一步深入研究。