基于SSR 标记的辽宁蒙古栎天然群体遗传多样性研究

陈 罡，卜鹏图，于世河，陆爱君，王骞春，王敬贤，冯 健

（辽宁省林业科学研究院， 沈阳110032）

蒙古栎(Quercus mongolica Fisch)为壳斗科栎属，是在我国分布最北的栎属物种，在中国的分布区域总体呈东北-西南走向, 连续性分布和非连续性分布共存[1]。 蒙古栎是我国东北和华北地区针阔叶混交林的主要建群种，是落叶栎类植物中抗逆性较强的林木，具有很好的涵水和保土作用；蒙古栎也是我国重要的工业和生态经济树种，其材质坚硬耐腐，纹理优美，可用于制作地板；树皮中单宁、鞣质含量丰富，可用作多种工业原料；同时，其种子富含淀粉，可食用，叶子可养蚕以及饲养动物[2]。因此，蒙古栎具有很高的经济和生态价值。蒙古栎在辽宁分布面积较大，是辽宁东部山区面积最大的森林植被类型。近年来，原生蒙古栎天然林受人为影响，有些地区的群体处于渐危或濒危状态，种质资源和遗传多样性受到破坏，因此，急需对蒙古栎现存的种质资源进行多样性研究，摸清其分布区内遗传多样性水平及遗传分化的程度，进而为蒙古栎种质资源的保存、育种和培育提供必要的分子水平的遗传背景[3]。 现有研究表明，不同分布区的蒙古栎群体遗传学特征和遗传背景尚不完全清楚，不同研究方法的结果和结论差异明显，这严重影响了蒙古栎的科学保护和合理利用。

目前，利用分子标记技术对蒙古栎遗传变异水平的研究主要为等位酶、RAPD、ISSR、AFLP 等[4]，所用的标记不同，揭示的蒙古栎遗传水平也不尽相同。随着分子标记技术的发展，共显性、高多态性、稳定性好、基因组广泛分布的微卫星分子标记(microsatellite，SSR)技术逐步发展并被引入到栎属物种的群体遗传学研究中[5-7]。 已有相关研究表明，栎属物种的SSR 遗传多样性是比较高的，研究结果也显示其群体间存在较高的基因流[8]，但对于栎属物种，很多研究所用到的SSR 标记都是利用其在近缘物种间的保守性和通用性[9]，迄今为止可用的蒙古栎SSR 标记数量还比较少[10-12]，除转移自近缘物种的SSR 标记，针对蒙古栎基因组和遗传背景开发的高特异性的SSR 标记极为有限。 因此，开发蒙古栎SSR 标记特异引物用于蒙古栎遗传多样性研究十分必要。 基于此，本研究在前期工作中利用新一代测序技术（NGS）全新开发了一批多态性好、试验重复性好的蒙古栎SSR 标记。在本研究中，应用这些新的蒙古栎专有SSR 标记，对采集自辽宁省的8 个蒙古栎天然群体的遗传变异进行研究，旨在为蒙古栎种质资源的遗传改良、多样性保护及育种造林提供遗传学基础和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

2018 年6 月下旬，课题组在辽宁省蒙古栎分布区采集了8 个天然群体的蒙古栎叶片，硅胶干燥保存备用。这8 个群体基本覆盖了蒙古栎在辽宁省的分布范围，分别是：抚顺大孤家（DA），抚顺哈达（HA），丹东宽甸（KUAN），朝阳凌源（LING），本溪清河城（QING），凤城土城子（TU），抚顺湾甸子（WAN），铁岭西丰（XIFENG）。每个群体选择15～20 株的树木(个体)，每个个体之间至少相隔50 m，采样点基本情况见表1。

1.2 DNA 提取方法

基因组总DNA 抽提采用CTAB 法提取硅胶干燥的新鲜叶片[13]，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 大小和完整性。 用NanoDrop ND-2000 分光光度计(Thermo Fish Scientific)测基因组总DNA 质量，用1×TE 缓冲液稀释总DNA（终浓度为20ng·μL-1），储存于-20℃冰箱内，用于SSR 试验。

1.3 SSR 分析

在GeneAmp 9700 PCR 仪上完成扩增（Applied Biosystems），反应体系（10μL）：10×Buffer I 1.0μL；2.5mM dNTP 0.8μL；带有M13 序列的荧光引物TP-M13(5μmol·L-1)0.5μL（HEX 或FAM 荧光）；特异SSR 引物(5μmol·L-1)0.6μL；TAKARA HS Taq(大连TaKaRa 生物)0.1μL；DNA 模板1.2μL；ddH2O 5.8μL。PCR 扩增：95℃在PCR 仪上进行预热5min；94℃模板变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，程序重复30 次循环；随后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸扩增30s，重复10 个循环；最后60℃持续30min。 向96 孔板中每孔加入分子量内标GS500 LIZ(Applied Biosystems)和甲酰胺混合液(0.5:8.5)9μL，PCR 产物1.0μL，95℃变性3 min。 带有不同荧光的PCR 扩增产物在ABI 3730XL 测序仪（Applied Biosystems）进行检测。 将检测得到的原始数据“.fsa”文件导入到分析软件GeneMapper 3.2(Applied Biosystems)中进行自动分析，手工校正。 北京阅微基因技术有限公司完成多色荧光引物合成、检测和SSR 分析。

表1 群体样本采样点信息Table 1 Population locations of Q.mongolica in the present study

1.4 统计与分析方法

共完成10 对SSR 引物的扩增（表2）。用Popgene32软件[14]计算各个引物的等位基因数(A)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(HO)、Shannon 多样性指数、期望杂合度(HE)、多态性信息含量(PIC)、基因流(Nm)、基因分化系数（FST）、群体遗传距离（Nei）与遗传相似性等。用Mega 7按群体之间的Nei"s 遗传距离进行UPGMA 聚类分析[15]，用软件Fstat 2.9[16]完成遗传距离与地理距离之间mantel相关性检验（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 蒙古栎群体的遗传多样性

由图1 可知，这10 对SSR 标记，具有很好的重复性和稳定性， 在所有的样本中均可成功扩增和进行判读。图1 为引物对N1105306 的荧光扩增产物在自动测序仪上的条带大小，模板分别来自DA、HA、KUAN 和LING群体的4 个个体。 由表3 可知，10 对引物共扩增出73个等位基因变异， 每个位点的平均有效等位基因数为2.813 个，平均观察等位基因数为7.3 个。 引物N4544558检测到的有效等位基因数最少，为1.678；引物N1010265检测到的有效等位基因数最多，达3.641。引物多态性信息含量(PIC)最高的为N1010265（0.683），最低的为N4544558（0.364）。10 个SSR 位点平均Shannon 多样性指数（I）为1.270（0.756～1.527）;平均期望杂合度为0.624（0.404～0.725）。

由表4 可知，除西丰群体（群体采样数量较少）之外，平均等位基因数最高的是哈达林场群体(A=5.0)，最低的是大孤家群体和宽甸群体(A=4.2)；平均有效等位基因数群体之间差异不大（2.403～2.896），分别是宽甸和凌源群体；Shannon 多样性指数差异也不大，最高是湾甸子群体(1.182)，最低是西丰群体(0.986，采样个体数仅有3个)；期望杂合度最高为湾甸子群体(0.612)，最低为清河城群体（0.558）。 蒙古栎群体遗传多样性处于较高水平，各群体的SSR 多态性水平变化范围不大，说明群体之间的差异较小。

表2 SSR 引物序列Table 2 The primers of sequence used for SSR analysis

图1 N1105306 引物的荧光PCR 扩增片段长度Figure 1 Fluorescent PCR fragment size of N1105306 primer

表3 10 个位点的遗传多样性、FST 与基因流Table 3 Genetic polymorphism,FST and gene flow of 10 SSR loci

表4 蒙古栎群体遗传多样性Table 4 Genetic diversity of Q.mongolica populations

2.2 蒙古栎群体间的遗传分化程度

由表3 可知，不同SSR 位点的基因分化系数FST 差别较大（0.0311～0.1600），N1010265 位点的分化最低（0.0311）位点，N1014482 位点的分化最高（0.1600），平均为0.0655。 这个结果意味着仅有6.55%遗传变异是发生在群体之间，而绝大部分的遗传变异发生在群体内(93.45%)。 估算出的物种水平平均基因流（Nm）基因流达到4.471（范围为1.313～7.780）。

2.3 群体间遗传距离

由表5 可知，宽甸和清河城群体之间的遗传距离最小(0.0076)；清河城和西丰群体的遗传距离最大(0.056)，从UPGMA 聚类图可以很清晰地看出各个群体之间的关系。

表5 遗传一致性和遗传距离Table 5 Genetic identity and genetic distance

由图2 可知，8 个群体可以分为3 个群： 群Ⅰ包括宽甸群体、清河城群体、哈达群体、湾甸子群体和土城子群体；群Ⅱ包括凌源群体和大孤家群体；群Ⅲ包括西丰群体。 Mantel 检验表明，这8 个群体的遗传距离和地理位置之间具有显著相关性(r=0.631，p＜0.05)，这说明地理距离与遗传距离存在正相关，符合地理隔离模型（isolation by distance）。

3 讨论与结论

图2 8 个蒙古栎群体的UPGMA 聚类图Figure 2 UPGMA dendrogram among the eight populations of Q.mongolica

本研究利用新开发的SSR 分子标记研究了辽宁分布的蒙古栎天然群体的群体遗传学特征， 结果表明，每个SSR 位点的平均等位基因数为7.3，平均期望杂合度为0.624，Shannon 多样性指数为1.270。 8 个群体存在一定的多样性差异，期望杂合度为0.558～0.612；群体分化系数为0.0655，群体之间存在基因流达到4.471，表明遗传变异主要存在群体内。 通过UPGMA 聚类将8 个群体分为3 个群，检验表明，其遗传距离和地理距离之间成正相关系。

辽宁省分布的天然蒙古栎群体具有较丰富的SSR 多样性， 其遗传多样性水平在栎属植物中处于较高水平。 多样性水平的高低决定了物种的进化潜力和对环境的适应能力，栎属植物种类繁多，形态多样，因此其遗传背景和多样性水平差异很大。 HORNERO 等[17]研究表明，欧洲栓皮栎具有较高的SSR 遗传变异水平，期望杂合度（HE）可达0.65。 我国分布的栓皮栎SSR 多样性水平明显高于欧洲栓皮栎(HE=0.81)和欧洲夏栎[18]，山西分布的辽东栎群体的SSR 遗传多样性接近中国栓皮栎（HE=0.753）[19]，而槲栎（HE=0.575）[20]和短柄枹栎（HE=0.43）[21]的SSR 多样性明显低于栓皮栎。 本研究利用10 对蒙古栎专有新标记，平均每个位点的期望杂合度可达0.624，平均等位基因数为7.3，平均Shannon 指数为1.270，这表明本研究所开发新引物的SSR 标记多态性较高， 利用这些SSR 标记研究辽宁蒙古栎群体的遗传多样性， 能够反映辽宁地区分布的蒙古栎的多样性水平（HE=0.588），虽然低于中国栓皮栎、辽东栎、欧洲栓皮栎（HE=0.65），与槲栎（HE=0.575）接近，但明显高于中国的短柄枹栎群体多样性水平（HE=0.43），即便与其他科属的林木遗传变异[22-25]进行比较，辽宁省内的蒙古栎的SSR 多样性也处于较高水平。

群体多样性水平或分化程度差异的可能原因在于选择、基因流、隔离或随机漂变等。 基因流动可以消除因地理或生殖隔离导致的不同地方群体甚至是物种间的遗传差异，减小种间或种内群体间的分化程度，进一步提高群体或物种的多样性和适应力。很多研究表明，蒙古栎群体间存在基因流。ISSR 标记分析得到的蒙古栎群体间基因流比较低(Nm=1.3818)，群体间有相当程度的遗传分化(GST=0.2657)[26]；等位酶标记揭示的蒙古栋群体间群体之间基因流要大于ISSR 的结果（Nm=2.071），群体间的遗传分化系数降低（GST=0.1077）[27]。同时，蒙古栎和近缘栎属物种的基因流也是普遍存在的，特别是在物种的重叠分布区[28]。本研究中的基因流（Nm=4.471）明显高于上述的结果，这可能源于SSR 标记方法的高多态性，这个结果很接近基于SSR 标记的山东莲台山蒙古栎的群体（Nm=4.22）结果，低于近缘的辽东栎（Nm=5.979），又明显高于中国短柄枹栎群体之间的基因流(Nm=1.88)[21]，说明蒙古栎群体之间确实存在较强基因流，基因流进而影响了蒙古栎群体的遗传结构，即较高的遗传多样性主要存在于群体内，群体间的遗传分化较低。 这种遗传变异的分布模式很大程度上要归因于栎属物种的交配方式。 栎属植物是风媒、异交为主，花粉很小，可以长距离传播，从而导致群体间存在广泛的花粉流介导的基因流，基因流的均质化作用反过来很大程度上又会减弱群体间的分化；遗传分化和基因流之间为负相关，基因流强度越大，群体分化就越小，这是栎属物种长期进化而适应生态环境的结果。

本研究中，蒙古栎群体的遗传距离和地理距离存在显著的正相关关系，这也与前人研究结果相一致[29]。 蒙古栎在辽宁地区有较大面积的分布，分布位置因地区差异也有明显变化，其主要区域分布在辽宁东部山区。 本研究采样的8 个地点中，从经纬度来看，抚顺（哈达、湾甸子、大孤家）、本溪（清河城）、丹东（宽甸、土城子）等地为辽宁东部山区，属长白植物系区[30]，气候、土壤等生境条件较为相近；而朝阳（凌源）在辽宁西部丘陵地区，属华北植物区系，其生境条件明显与其他几个地区不同。 通过聚类分析也说明，不同区域生长的蒙古栎群体存在一定多样性水平差异，而在聚类图中，铁岭西丰单独聚到了一类，其多样性指数最低，虽然铁岭西丰地区也属于长白山余脉地区但与其他群体间遗传距离相对较远，这可能与本次群体采样数量较少有关，对于上述存在的遗传差异原因及其与生长性状和地理气候因子的相关性还有待于今后进一步深入研究。