桔绿木霉Snef1910 联合噻唑膦防治根结线虫减施增效研究

刘晓宇，王媛媛，范海燕，段玉玺

（沈阳农业大学 植物保护学院/北方线虫研究所，沈阳110161）

根结线虫病是设施蔬菜的主要土传病害之一[1]，东北地区设施蔬菜的种植环境非常适合根结线虫的生存，因此随着种植面积的逐年增加，根结线虫病害也日趋严重。 东北地区温室蔬菜根结线虫的一般发病率在65%以上，严重地区发病率可达到100%[2]，给农户造成了巨大的经济损失。 生产上蔬菜根结线虫病的防治仍以化学农药为主，化学农药因高效价廉和施用简单等优点而备受农户青睐，但同时化学农药的高毒和高残留又不可避免地危害着人的生存环境和食品安全。推进农业绿色发展是农业供给侧结构性改革的主攻方向，加快农药减量增效是促进农业绿色发展的重要措施。 减药增效的常用措施包括：合理选择用药、适时用药、严格掌握用药量、坚持轮换用药和合理复配混用农药。 近几年，生防菌剂与化学农药的复配混用成为研究热点[3-5]。 生防菌剂在有机农业使用的整合害虫管理系统(IPM)中扮演重要的角色。 它具有选择性强和对环境安全性高等优点，但是生物菌剂不具广效性、见效慢、有效期短和成本高等缺点却限制了它取代化学农药的进程。那么，两者的联合应用研究就是期望能够扬长避短，从而实现病害防治的高效和低残留的目标。

本课题组前期从土壤中筛选获得一株高效杀线虫生防菌Snef1910，经鉴定为桔绿木霉（T.citrinovirid），其次生代谢物对甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)、大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的致死率均可达到80%以上，具有很好的生防潜力[6-7]。 国际上已经认定木霉菌(Trichoderma spp.)为重要生物防治菌，在病害防治过程中还具有促进植物生长和诱导抗性的能力[8-9]。 本研究利用桔绿木霉Snef1910联合噻唑膦共同防治根结线虫病害，通过测定两者的施用次数和施用顺序对植株的生长、土壤中线虫2 龄幼虫的数量（J2）和药物对病害的防效等指标的影响，探究桔绿木霉Snef1910 与噻唑膦的联合施用是否可以实现化学农药噻唑膦的减量增效，为线虫病害的绿色防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试75%噻唑膦乳油为河北三农农用化工有限公司生产。 供试桔绿木霉snef1910 由沈阳农业大学北方线虫研究所-20℃下保存；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存编号：CGMCC No.13569。 供试番茄 （Lycopersicon esculentum Mill） 品种为谷雨天赐1 号。 试验在辽宁省铁岭市李千户镇营盘村的日光温室（123.92E，42.18N）进行。 定植前，每100g 土中含成虫量约8000 条，分布均一，属于严重病害大棚。

1.2 方法

温室田间试验采用完全随机区组设计，每垄长6m，垄宽0.5m，垄间距0.3m，每垄28 株。试验共设6 个处理组：snef1910 仅在定植期灌根施用1 次（snef1910-1）；噻唑膦仅在定植期灌根施用1 次（F-1）；snef1910 在定植期和30d 后各施用1 次（snef1910-2）；噻唑膦在定植期和30d 后各施用1 次（F-2）；snef1910 在定植期施用1次，30d 之后施用噻唑膦1 次 （snef1910+F）； 噻唑膦在定植期施用1 次，30d 之后施用1 次snef1910 （F+snef1910）。 每个处理3 次重复， 另设清水对照。 药后90d 取样测定各相关数据。 药剂用量：75%的噻唑膦EC 200mL·hm-2，稀释6000 倍，每株灌根施用200 mL；snef1910 发酵液稀释30 倍，每株灌根施用200mL[12]。

1.2.1 桔绿木霉发酵液的制备[10]取活化的桔绿木霉Snef1910 置于平板培养形成菌落，利用5mm 打孔器获得菌饼，置于150mL 马铃薯葡萄糖培养液中，28℃，120r·min-1恒温培养振荡培养5d，得到Snef1910 种子液。 将种子液接种于30L 发酵罐的PDB 培养液中，28℃，220r·min-1发酵培养5d，得到Snef1910 菌株发酵液，稀释30 倍备用。

1.2.2 噻唑膦对桔绿木霉菌snef1910 的生长抑制测试[11]依据噻唑膦田间使用量作为中间浓度，配制含有噻唑膦5 种梯度浓度的PDA 培养基：以9cm 培养皿中倒入10mL 培养基计算，每皿分别加入田间试验施用浓度0.6，0.8，1.0，1.2 和1.4 倍浓度的农药稀释液。 在培养皿中央接入直径为0.5cm 的桔绿木霉菌饼，每种处理浓度均有3 次重复，以不加农药的平板作为对照（CK），25℃培养，分别于48h 和72h 使用十字交叉法测量菌落直径增长。

1.2.3 各处理对番茄植株根部生长的影响 移栽后90d，每个处理随机取5 株番茄植株连根挖出，保持根系完整，流水除去根部的泥沙，测量番茄植株的根长、根鲜重和根干重[12-13]。

1.2.4 各处理对温室番茄根结线虫的防治效果测定 取20cm 深根际土壤100mL， 采用蔗糖悬浮离心法分离根结线虫2 龄幼虫（J2）并在显微镜下计数，每处理重复3 次[14]。

根系鲜样用于根结指数和防效计算分析[15]。

根结指数分级标准：0 级，没有根结；1 级，根结占整个根系的1%～15%；2 级，根结占整个根系的16%～25%；3级，根结占整个根系的26%～50%；4 级，根结占整个根系的51%～75%；5 级，根结占整个根系的76%以上[16]。

1.3 数据分析方法

试验所得数据结果采用Microsoft Office Excel 2016 软件和SPSS 17.0 软件进行统计分析，并采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 噻唑膦对桔绿木霉菌snef1910 的生长抑制测试

由图1 可知，桔绿木霉Snef1910 在48h 已经长满平板，72h 产孢量增加。 说明噻唑膦在田间试验的用量范围不会抑制桔绿木霉Snef1910 的生长，两者无论混用或者顺序施用都不会影响彼此的防治效果。

图1 噻唑膦对桔绿木霉Snef1910 的生长抑制Figure 1 The inhibition assay of fosthiazate to T.citrinovirid Snef1910

2.2 各处理对番茄植株根部生长的影响

试验地温室大棚属于严重病害，移栽90 d 取样时，清水对照（CK）的植株根结严重，根部发育受损，分级均为5 级。 由图2 可知，相对于对照，施用药剂处理的植株根长显著增长。 其中，经2 次噻唑膦灌根处理（F-2）的根最长29.82 cm，比对照增长37.93%；F+Snef1910 处理的根长增长率为32.38%，与F-2 相近。 Snef1910+F 相比F+Snef1910 对根长的影响并不显著，即噻唑膦和木霉的施用顺序对根长的影响并不显著（图2A）。 由图2B 可知，CK 布满根结导致根鲜重和根干重数值最大。经药剂处理，根结减少，健康的须根增多，根干重和根鲜重的数值均显著降低。 Snef1910-1、F-1、Snef1910-2、F-2、Snef1910+F 和F+Snef1910 处理的根鲜重的降低率分别为45.57%、63.98%、28.37%、49.50%、43.69%和58.04%； 对于根干重的减少率分别为31.91%、35.65%、14.86%、40.24%、30.26%和47.45%。 根部的重量变化需要结合图3 和图4 中根的实际状态来分析。

由图3 可知，CK 根结严重，6 个处理组根结显著减少，须根明显增多。 但Snef1910-1 和F-1 只施用1 次药剂根区根结比对照减少，有少量须根；经Snef1910-2、F-2、Snef1910+F 和F+Snef1910 处理的根部根结较少，出现更多健康的须根（图4），结合图2B 的数据，根的重量受到两个因素的影响：根结数量和须根的数量。 目测观察，F+Snef1910 的根结最少，须根最多，外观与F-2 相似。 Snef1910+F 的根结和须根的情况与F-1 相似。

图2 田间试验中不同处理对番茄生长的影响Figure 2 Influence of different treatments on the tomato growth

图3 温室田间试验中不同处理后受根结线虫侵染番茄的症状表现（90d）Figure 3 Symptom performance of the tomato plants infested with Meloidogyne incognita on 90 days after different treatments in field experiment

图4 温室田间试验中2 次用药处理后受根结线虫侵染番茄的症状表现（90d）Figure 4 Symptom performance of the tomato plants infested with Meloidogyne incognita on 90 days after using nematicide twice in field experiment

综合图2、图3 和图4 的结果，F-2 和F+Snef1910 对番茄根部生长的影响效果相似，说明定植期施用噻唑膦，定植期后再施用Snef1910 有利于番茄根部的生长发育。

2.3 各处理对温室番茄根结线虫的防治效果

由表1 可知，F+Snef1910 和F-2 的防效最高为68.00%，与F-1 和Snef1910+F 的防效差异性不显著，但与Snef1910-1 和Snef1910-2 的防效差异显著。 经Snef1910-1、F-1、Snef1910-2、F-2、Snef1910+F 和F+Snef1910处理的每100mL 土中的J2 数量比对照分别降低46.04%、48.52%、53.19%、66.32%、48.84%和58.76%。 无论从防效还是对土壤中J2 数量的控制能力方面，F-2 都是最好的。 其次是F+Snef1910。 但是，F+Snef1910 的增产率是最高的76.50%，远高于F-2 的59.68%和Snef1910+F 的58.18%。

表1 不同处理对南方根结线虫的温室田间防效Table 1 Control efficiency of different treatments on Meloidogyne incognita in the field experiments

3 讨论与结论

木霉菌（Trichoderma spp.）是一种很重要的生防资源，具有适应广、代谢物多样和环境友好等特点。1932 年WEINDLING 发现木霉可以通过寄生而导致病原微生物的死亡[18]，由此开启了木霉在植物病害防治方面的深入研究。 已报道的木霉可防治的病害包括番茄立枯病[19]、辣椒疫病[20]、杨树叶枯病[21]、玉米秸秆腐病[22]、炭疽病[23]和各种土传病害[24]。 根结线虫病害是土传病害之一，王贻莲等[25]利用木霉菌LTR-2 和T11-W 形成组合菌剂和营养基质防治黄瓜根结线虫；翟明娟等[26]筛选获得了绿色木霉Tvir-6 的发酵液对根结线虫2 龄幼虫具有极高毒力，田间防效可以达到64.9%；李登辉[27]测试了钩状木霉T21 诱导番茄抗根结线虫的能力，菌株处理的番茄相比对照根结数量减退67.23%；张树武等[28]研究长枝木霉T6 菌株在黄瓜根际具有较强的定殖作用，对被南方根结线虫侵染的植株具有很好的促生作用。 此外，还有康宁木霉[29]和哈茨木霉[30]等都被报道了具有防治根结线虫病害的作用。近年来，化学农药结合生物农药防治土传病害成为研究热点。众多研究均采取两者混用的方式，在有效控制病害的同时降低化学农药使用量[31-32]。但是，通过混用的方式实现两者对病害的协同控制，必须在生防菌与化学农药相容的前提下进行，高浓度的化学药剂对生防菌生长一般都有抑制作用，而不同菌株忍受药剂的种类和浓度也不同。 因此，通过生防菌与化学农药混用的方式减少化学农药的使用量，实现化学农药的减施增效受到多方面的限制，也使这种混合模式的应用难以推广。本研究将生防菌和化学农药在作物生长期分阶段单独施用，通过减少化学农药的施用次数实现减施的效果，利用药剂不同的防病机制在作物生长的不同阶段发挥作用，实现增效，由此可以避免生防菌与化学农药混用的拮抗问题。

本研究发现，当线虫病害严重时，仅利用生防菌无法有效防治病害，必须利用化学农药进行干预。种植期增加噻唑膦的施用次数可以提高防效，但过量施用噻唑膦可能会造成药物残留和烧根现象。两者施用顺序会对防效和产量有较大影响，这种结果可能与两者的作用机理有关。 噻唑膦具有较强的触杀能力，在定植期施用噻唑膦可以快速降低线虫2 龄幼虫的数量，降低侵染率，同时它还可内息传导至植物体内，杀灭根系中的线虫，施药1 次的有效期为30～40d；30d 后施用木霉菌Snef1910 可以巩固噻唑膦的防控效果，木霉活菌对于线虫的防控机理比较复杂，通过触杀、诱导抗性和增厚根部组织结构等多种方式帮助植株防控线虫侵染，最重要的是木霉发酵液中含有大量营养物质，给生长期和结果期的植株提供大量养分，从而起到增加产量的作用。相反，在定植期施用木霉Snef1910，病害严重的土壤中，2 龄幼虫密度高，活菌制剂对线虫的触杀能力很难超越化学农药，前期会出现较高侵染而降低总体联合防治效果。 本研究结果可为木霉联合其他化学杀线剂实现减施增效提供参考。