草酸强化超富集植物东南景天修复镉铅污染土壤研究

魏忠平，谷雷严，罗 庆，王 辉，马冬菁，武文昊

（1.辽宁省林业科学研究院，沈阳110032；2.沈阳大学 区域污染环境生态修复教育部重点实验室，沈阳110044；3.辽宁省林业调查规划监测院，沈阳110122）

当前，我国重金属污染物排放总量仍处于高位水平，重金属污染依然较为严重，镉（Cd）、铅（Pb）作为重要的金属资源在工业生活中被广泛使用，在造福人类的同时也造成了严重的环境污染[1]。 土壤中的重金属能够通过影响植物根系吸收营养元素、 引起植物细胞超微结构的改变以及影响植物光合作用和呼吸作用等严重影响植物发育和作物的产量并通过食物链放大最终危害人体健康[2]。 已有研究表明，土壤中Cd、Pb 可能对玉米籽粒中的蛋白质含量造成影响[3]，Pb 污染会抑制辣椒的萌发[4]。 目前，土壤重金属污染修复技术主要包括稀释法、固定/稳定化技术[5]、化学还原法[6]、土壤淋洗[7]、电动修复法[8-9]和生物修复法[10]等。 同其他修复技术相比，生物修复法因具有成本低、易操作、生态友好等优点[11]而具有广阔的应用前景。生物修复还可以进一步细化为植物修复、微生物修复和植物-微生物联合修复技术[12]。 虽然在实验室的理想化条件下微生物修复技术的表现良好[13]，但是具体到实际环境时，由于干扰因素较多，如温度、pH 值等，会使该技术受到限制而无法发挥其优势。 相比之下，植物修复技术对环境条件有更强的适应性，其抗性强、耐受重金属浓度高的特点已成为研究热点[14]。

植物修复技术当前主要存在着修复效率较低、修复周期长的问题。 添加有机酸能够增加土壤中Cd、Pb 的有效态含量，提高其生物有效性，进而促进植物对Cd、Pb 的转运和富集。 研究表明，有机螯合剂（柠檬酸，乙酸，苹果酸，草酸等）的应用显著提高了各种植物物种对金属的吸收[15]。 例如，向土壤中添加乙二胺四乙酸（EDTA）后，其以自由形式进入植物根系，在根系与金属结合并增强金属在植物体内的流动性[16]，有效态Pb 含量显著提高[17-18]，显著促进了植物地上部对Pb 的吸收[19]。添加外源柠檬酸对Cd 从根部迁移至地上部具有积极作用[20-21]。外源苹果酸和乙酸可减少Cd 的植物毒性并增强Cd 在向日葵植物根系中的积累[22]。本课题组前期研究发现，东南景天在受到Cd、Pb 胁迫时，根际草酸分泌量较未受胁迫时有显著增加[23]。 因此，本研究以超富集植物东南景天为研究对象，探讨草酸添加对东南景天富集土壤中Cd、Pb 的促进作用，并考察添加草酸对土壤pH 值、有机碳、营养元素等理化性质的影响，以期为提高重金属污染土壤的植物修复效率提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 盆栽试验

供试土壤采自辽宁省沈阳市沈北新区一块重金属污染农田，采样深度为0～20cm。土样经自然风干后，剔除其中的石块和动植物残体，部分大颗粒经碾碎过孔径为2mm 的标准筛贮存备用。该土壤样品的理化性质为：土壤有机质含量为5.44%，阳离子交换量为13.09cmol·kg-1，pH 值7.17，土壤容重1220kg·m-3，粘粒、粉粒和砂粒含量分别为26.11%、72.82%、1.07%，重金属Cd、Pb 的平均含量分别为0.61mg·kg-1和135.4mg·kg-1。

供试植物富集生态型东南景天（Sedum alfredii）采集自浙江省衢州市一个古老的铅锌矿区，地理坐标为：东经118°56"，北纬29°17"。

准确称取3kg 土壤样品装入深40cm 的花盆中，加入分析纯KH2PO4300mg·kg-1、NH4NO3400mg·kg-1作为基肥，混匀，并加水保持持水量为50%～60%，稳定5d 后备用。试验共设置6 个处理，重复3 次（表1）。东南景天移栽1 个月后（此时东南景天已长出较旺盛根系）施用草酸淋洗剂，东南景天移栽4 个月后收获。 分别收集东南景天的地上部和根部， 分别收集0～20cm 和20～40cm两个土层的东南景天根际土。

1.2 土壤及植物样品中重金属的测定

将收获的东南景天于105 ℃烘箱中杀青30min，然后在60℃条件下烘干至恒重，测定干物质量。 用研钵将植物研碎磨细，过0.9mm 筛，使用HNO3/HCl 双酸法进行电热板消解，火焰原子吸收分光光度法测定Cd、Pb 浓度[24]。

表1 草酸强化植物修复试验处理Table 1 Treatments of oxalic acid reinforced phytoremediation

土壤样品使用HNO3/HCl 双酸法进行电热板消解，火焰原子吸收分光光度法测定Cd、Pb 浓度[24]。

1.3 土壤理化性质的测定

土壤pH 值测定采用酸度pH 计法[25]；土壤阳离子交换量测定采用乙酸铵交换法[26]；土壤有机碳测定采用重铬酸钾外加热法[27]；全氮测定采用半微量开氏法[28]；全磷测定采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法[29]；全钾测定采用氢氧化钠熔融-火焰光度法[30]。

1.4 数据处理

所有结果均以均值±标准差表示，使用Origin 9.0(Origin Lab Corporation,Northampton,MA)作图，采用SPSS 24.0 进行单因素方差分析[最小显著差数法（LSD），不同字母表示不同处理间存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 草酸添加对土壤中Cd、Pb 含量的影响

图1 是东南景天移栽前和收获后表层（0～20cm）和底层（20～40cm）土壤中Cd 的含量以及表层和底层土壤中Cd 的消减率和增加率。 由图1 可知，对照的表层土壤中Cd 含量有一定的减少，这可能是浇水形成的淋滤作用，导致表层土壤中的Cd 进入到底层土壤，但这种由水产生的淋滤作用非常细微。 种植东南景天后，表层土壤中Cd 含量有一个显著的下降，下降率为21.4%；而底层土壤中Cd 含量却有一定的增加，增加率为1.6%。 这表明东南景天仅能吸收富集其根际土壤中的Cd，底层土壤远离其根部，底层土壤中的Cd 未被东南景天吸收富集。底层土壤中Cd 含量的增加，原因与对照相似，可能是由浇水形成的淋滤作用导致。

当施用草酸淋洗液后，表层土壤中的Cd 含量进一步下降，下降率随着草酸淋洗液浓度的增加而显著增加，当草酸浓度为50mmol·kg-1土时，下降率达到63.5%。而底层土壤中Cd 含量一直增加，当草酸浓度为50mmol·kg-1土时，底层土壤中Cd 增加量为0.06mg·kg-1，增加率到达10.5%，与20mmol·kg-1土的草酸淋洗液相比，增加率有一个明显的提高。 这表明草酸的添加能显著提升东南景天的修复效率，但当草酸添加浓度过大时，草酸活化的Cd 过量，而东南景天吸收富集Cd 的速率一定，多余的Cd 就会通过淋滤作用进入到下层土壤，对下层土壤造成污染。 因此，应选择既能够促进东南景天的修复效率、又能够不形成淋滤作用对下层土壤造成污染的合适的草酸添加浓度。 本试验表明，草酸的添加量为20mmol·kg-1土时，可满足该要求。

图1 表层和底层土壤Cd 含量Figure 1 The content of Cd in top and bottom soil

图2 是东南景天移栽前和收获后表层和底层土壤中Pb 的含量以及表层和底层土壤中Pb 的削减率和增加率。 由图2 可知，土壤中Pb 的变化趋势与Cd 的变化趋势相似。 种植东南景天能显著降低表层土壤中Pb 的含量，草酸能显著促进东南景天对Pb 的修复效率。 草酸添加的浓度越高，表层土壤中Pb 含量降低的越多。 由于淋滤作用，底层土壤中的Pb 含量一直呈增加趋势，当草酸浓度增加到50mmol·kg-1土时，底层土壤中Pb 增加量为20mg·kg-1，增加率达到14.8%，与20mmol·kg-1土时的3.6%相比，增加率有一个明显的提高。 这也表明草酸的添加能显著增加东南景天的修复效率，但当草酸添加浓度过大时，草酸活化的Pb 过量，而东南景天吸收富集Pb 的速率一定，多余的Pb 就会通过淋滤作用进入到下层土壤，对下层土壤造成污染。 因此，本研究选择草酸的添加量为20mmol·kg-1土。

图2 表层和底层土壤Pb 含量Figure 2 The content of Pb in top and bottom soil

2.2 草酸添加对东南景天中Cd、Pb 含量的影响

由图3 可知，施用草酸淋洗液后，东南景天地上部和根中Cd、Pb 含量均增加，并且随着草酸淋洗液浓度的增加而显著增加， 这表明草酸能够促进东南景天对重金属Cd、Pb 的吸收富集。 但是， 当草酸淋洗液浓度从20mmol·kg-1土增加到50mmol·kg-1土时，东南景天地上部和根中Cd、Pb 含量差异不显著，这表明东南景天对Cd、Pb 的吸收富集趋于饱和。

不同深度土壤中Cd、Pb 含量的变化情况和东南景天中Cd、Pb 含量的变化情况均表明，草酸能够促进东南景天对土壤中Cd、Pb 的吸收富集，但过量的草酸会导致表层土壤中的Cd、Pb 向下层土壤迁移，污染下层土壤。因此， 选择20mmol·kg-1土的草酸添加浓度较为合适， 既可最大限度促进东南景天对土壤中Cd、Pb 的吸收富集，又能确保表层土壤中的Cd、Pb 不向下层迁移。

图3 东南景天Cd、Pb 含量Figure 3 The content of Pb and Cd in S.alfredii

2.3 草酸添加对土壤理化性质的影响

为评估草酸添加对土壤理化性质、土壤质量的影响，本研究分析了6 个处理条件下土壤pH 值、土壤有机碳含量以及土壤营养元素全氮、全磷和全钾的含量。 由图4 可知，当草酸添加量较少时，土壤pH 值的变化较小，可忽略。 当草酸添加量增加到50mmol·kg-1土时，土壤pH 值从7.17 降至7.02，对土壤表现出一定的酸化作用。 种植东南景天后，土壤的有机碳含量有一定程度的增加，增加量约为0.2%，这可能是东南景天根系分泌物以及根系在土壤中的残留，使得土壤有机碳含量增加。 添加草酸与未添加草酸种植东南景天相比，土壤有机碳含量变化较小，表明草酸的添加对土壤有机碳含量没有影响。 与对照相比，种植东南景天降低了土壤营养元素全氮、全磷和全钾的含量，降低量分别为0.16，0.11 和0.26g·kg-1，这可能是东南景天在生长过程中对土壤中营养元素的摄取，使得土壤中营养元素氮磷钾的减少。添加草酸与未添加草酸种植东南景天相比，土壤中全氮、全磷和全钾的含量变化较小，这表明草酸的添加对土壤中营养元素全氮、全磷和全钾的含量没有影响。

图4 表层土壤的pH 值，有机碳和全氮、全磷、全钾含量Figure 4 The pH, the content of organic carbon and N, P and K in topsoil

3 讨论与结论

植物对金属的吸收富集包括金属在土壤中的解吸、可溶性重金属通过扩散或质量流迁移至根系表面、根对金属的吸收和向地上部转移等一系列过程。 东南景天主要通过共质体运输完成对土壤中Cd 的根部吸收、木质部装载、转运至地上部[31]。 外源小分子有机酸的添加会导致东南景天根际的pH 值降低，与金属离子络合，从而影响土壤对金属离子的吸附和植株对金属离子的吸收[32]。 已有研究表明，草酸施加量与土壤中可交换态Cd 呈显著正相关，添加草酸后，重金属离子被活化,可交换态重金属含量增加，同时提高了重金属在土壤溶液中移动性,使根系能有更多的机会与重金属接触，加速了其向木质部的转运，相较于对照组可以看到表层土壤内的Cd和Pb 浓度有一个显著的下降，说明草酸对东南景天吸收富集Pb 和Cd 有显著的促进作用[33]。 LI 等[34]在试验中观察到在1.5mmol·L-1柠檬酸和3mmol·L-1草酸处理下，苎麻根部对Cd 的吸附分别提高1.3 倍和1.2 倍，地上部Cd 均增加2 倍。 这与本研究结果基本一致。

Cd 和Pb 在东南景天地上部和地下部的分布存在差异，表现在植物地上部Cd 浓度远高于地下部，Pb 浓度地下部高于地上部，这与之前的研究一致[35-37]，即植物各部对Cd 的富集能力：叶＞茎＞根；对Pb 的富集能力：根＞茎＞叶。 有研究表明，东南景天根部Pb、Cd 都主要分布于根尖分生组织和中柱里[38]，随着与根面距离的增加,土壤有效态Cd、Pb 的含量表现出升高的趋势[39]。植物叶片中部Cd 在维管组织和上皮层含量较高，Pb 主要积累在叶脉中，其次则是表皮；在植物茎部90%以上的Pb 积累于维管束中[20]。 LI 等[34]推测了Cd 在植物体内的分布过程：pH 值的增加以及有机酸中强有机配体的释放进入植物-溶液界面，增加了Cd 的溶解度和有效性，促进了Cd 被苎麻根系吸收并转移到茎部；质膜中的ATP 酶被激活，导致负责金属转运的离子发生改变所以转移因子增加；有机酸螯合重金属有效参与植物木质部金属离子远距离转运，避免了游离金属离子毒性；螯合-金属复合体可能通过破坏根内皮层和卡氏带进入植物组织，随后在蒸腾作用的协助下向上迁移到地上部。

韩洋等[43]的研究表明，添加少量草酸并不会对土壤pH 值产生影响，这与本研究结果一致。通过比较空白样本可以看出，种植东南景天后土壤氮磷钾含量有少许下降，氮、磷、钾被视为植物合成自身所需蛋白质、叶绿素和酶以及影响自身代谢的重要物质，对植物完成自身生理活动起关键作用。 植物对Cd 的吸收是一个能量依赖的活性过程，因此可能存在添加草酸之后东南景天加速吸收重金属导致植物自身能量消耗速度加快，从而导致土壤中氮、磷、钾含量的下降，但是目前来看这种影响十分微小[31]。虽然有研究表明，乙酸、柠檬酸等有机酸对土壤的淋洗可通过溶解土壤中原有氧化物、碳酸盐和有机质等造成土壤物理化学性质的改变[40-42]，但是本研究的结果表明，草酸的添加对土壤理化性质的影响微小，通过显著性差异分析可以看出添加草酸前后土壤理化性质并无显著变化。 其原因可能是土壤淋洗是短时间、瞬时的，没有考虑土壤本身具有强大的缓冲能力和自净能力。

总的来看，添加草酸能够显著提高东南景天对Cd 和Pb 污染土壤的修复效率，草酸添加量为20mmol·kg-1土时最为合适，在这一条件下既能显著促进东南景天吸收富集表层土壤中的Cd 和Pb，又不会因过量活化Cd、Pb 使其通过淋滤作用向下迁移污染底层土壤。 本研究结果还表明，添加草酸不会对土壤Ph 值、有机碳和氮磷钾含量造成明显的影响。