应用高通量测序技术检测甲状腺乳头状癌相关基因变异

杨德仁,王卓,马蓉

(江苏省肿瘤医院﹠江苏省肿瘤防治研究所﹠南京医科大学附属肿瘤医院 a.检验科，b.临床肿瘤实验中心，南京 210009)

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤，近年来发病率不断升高[1-2]。其最常见的病理类型为甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)，约占所有甲状腺癌的85%～90%[3-4]。临床上通常采用Sanger测序技术、免疫组化技术及实时荧光定量PCR技术等对PTC相关单个基因，尤其是BRAFp.V600E基因位点进行检测，为辅助鉴别诊断、预后和治疗提供依据[5-6]。近年来，与甲状腺恶性肿瘤的鉴别诊断、预后与治疗密切相关的新的分子标志物不断涌现[7]。高通量测序技术(next generation sequencing，NGS)作为新一代测序技术，可同时检测多个基因的多种变异类型，并可进行定量分析[8]。

本研究采用NGS技术及包含BRAF、HRAS、KRAS、NRAS、TERT、RET、PIK3CA、PTEN、TP53、CTNNB1、AKT1、GNAS、PAX8/PPARγ、NTRK1和TSHR等15个目标基因主要内含子和外显子的引物池对PTC患者进行基因检测并分析其结果。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2019年1月至2020年6月于南京医科大学附属肿瘤医院头颈科收治且术后经病理诊断为PTC患者的石蜡包埋样本188例。其中男性66例，女性122例，年龄20～75岁，中位年龄46 岁。纳入标准：(1)病理组织学明确诊断为PTC；(2)未合并其他肿瘤；(3)分期明确且病例资料完整。按照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第八版[9]分为Ⅰ期151例，Ⅱ期27例，Ⅲ期3例，Ⅳ期7例。本研究经南京医科大学医学伦理委员会批准(南医大伦审2020148号)，所有研究对象均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 Nanodrop2000分光光度计(美国Thermo Scientific公司)， Huber Minichiller 300基因打断仪(德国Huber公司)，Biometra TONE PCR扩增仪(德国Biometra公司)，Novaseq 6000 基因测序仪(美国Illumina公司)。核酸提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，德国凯杰公司)，捕获磁珠(美国Beckman Coulter公司)。

1.3DNA 提取 按照核酸提取试剂盒说明书操作提取188例石蜡包埋样本的DNA。采用Nanodrop2000分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的片段化程度。取吸光度(A260/280 nm)值在1.7～1.9之间，DNA浓度大于10 ng/μL的样本，置于-20 ℃保存。

1.4NGS文库构建 提取的DNA首先通过Huber Minichiller 300基因打断仪进行打断。然后进行末端修复，磷酸化和添加“adaptor”接头。采用PCR技术扩增已添加“adaptor”接头的DNA。利用捕获磁珠纯化扩增产物，使用捕获探针进行杂交，利用磁珠进行筛选。再次对产物进行PCR扩增，并添加单端“index”标签。文库混合，利用Novaseq 6000 基因测序仪进行测序。

1.5生物信息学分析 通过BWA Aligner 0.7.10软件将测序原始数据与人类基因组(hg19)进行比对。利用GATK 4.0.2.0和VarScan.v2.3.9软件分析基因突变数据。利用Factera 1.4.4软件分析基因融合数据。目标区域平均测序深度≥500×，目标区域覆盖率≥99%，目标区域测序深度均一性≥90%。基因突变频率大于1%的样品视为阳性突变。

2 结果

2.1基因突变在PTC患者中的分布情况 共计80.32%(151/188)的标本检出突变，19.68%(37/188)的标本未检出突变。此外，74.47%(140/188)的标本检出1个点突变或基因融合突变，5.32%(10/188)的标本同时检出2个点突变，其中BRAF和TERT基因双突变 6例，BRAF和CTNNB1基因、GNAS基因、TP53基因、PIK3CA基因双突变各1例。0.53%(1/188)的标本同时检出TERT、NRAS和TP53基因3个点突变。151例突变标本中共计检出点突变及基因融合突变163个，其中BRAF基因突变率最高(表1)。BRAF基因突变均为典型的p.V600E位点突变。TERT基因突变以启动子区C228T位点突变为主。RET基因融合突变以CCDC6-RET基因融合突变为主。基因融合突变均为独立出现。

表1 高通量测序法检测PTC患者基因突变种类汇总

2.2基因突变丰度比较 结果表明，基因点突变等位基因突变丰度范围为1.10%～48.04%。基因融合突变读长(reads)比例范围为2.30%～55.52%。在双突变的标本中，2个不同突变等位基因突变丰度基本一致。此外，在TERT、NRAS和TP533个基因同时发生突变的标本中，TERT和NRAS基因等位基因突变丰度基本一致(分别为33.62%和39.67%)，而TP53基因等位基因突变丰度仅为4.13%。

2.3PTC患者基因突变与临床病理参数间的关系 Pearsonχ2检验结果表明，PTC患者基因突变与性别(χ2=0.585，P>0.05)、年龄(χ2=0.575，P>0.05)及临床分期(χ2=0.711，P>0.05)均无相关性。见表2。

表2 PTC患者基因突变与临床病理参数间的关系

3 讨论

以NGS技术为基础的基因检测在PTC患者中的应用已见报道。通过对PTC患者基因突变进行高通量分析，可为全面了解PTC相关肿瘤生物学特性提供技术支持。近年来研究表明，除BRAF基因外,HRAS、KRAS、NRAS、TERT、RET、PIK3CA、PTEN、TP53、CTNNB1,AKT1、GNAS、PAX8/PPARγ、NTRK1和TSHR等基因也被临床上用于甲状腺恶性肿瘤的鉴别诊断，并证实与患者预后及治疗密切相关[7,10-18]。故而本研究选择了上述15个目标基因进行NGS检测，分析其在PTC患者中的变异情况。

本研究结果证实，TSHR、AKT1、PETN、KRAS和PAX8基因未检出突变，这与一些国内外的研究报道的结果不一致[7,10,19]。Ke等[19]研究指出，甲状腺肿瘤患者基因突变类型包括点突变、插入/缺失突变、基因融合突变等多种类型，并进一步证实插入/缺失突变存在于甲状腺髓样癌中，插入/缺失突变可能是甲状腺髓样癌特有的突变类型，却不存在于乳头状癌中。而本研究仅发现点突变和基因融合突变两种类型。

赵竞等[7]研究指出，BRAF基因p.V600E位点突变发生于36%～83%的病例中，且通常是独立出现，不与RET/PTC重组或RAS突变同时存在。BRAF基因p.V600E位点突变为本研究中最主要的突变类型，并证实其不与RET/PTC重组或RAS突变同时存在。但本研究发现14例标本发生了含有BRAF基因p.V600E位点突变的双突变事件，具体原因尚需进一步分析。TP53基因作为重要的抑癌基因，通常认为仅发生在未分化的甲状腺癌中，但近期研究[7]表明，乳头状癌和滤泡状癌中也存在TP53基因突变，且通常预后很差。本研究中也检测出1例PTC患者存在TP53基因突变，进一步证实了TP53基因并不局限存在于未分化的甲状腺癌中。

本研究发现的双突变的标本中，2个不同突变等位基因突变丰度基本一致，这表明突变均来源于相同的细胞克隆群。但在1例3个基因同时发生突变的标本中，TP53基因的等位基因突变丰度显著低于其他2个基因，推测原因可能是TP53基因突变是此肿瘤克隆进展的晚期事件。

本研究也存在以下不足之处：(1)样本量偏少且来源单一，本研究188例标本均为手术后癌组织石蜡包埋标本，并未涉及细针穿刺活检及空芯针穿刺活检标本；(2)本研究仅检测DNA突变及RNA融合突变，并未将非编码单链RNA分子(miRNA)和长链非编码RNA(LncRNA)等肿瘤领域热门的分子标志物纳入研究范围。下一步的研究将加大样本量及样本类型，并扩大检测研究的范围。

综上所述，利用NGS技术检测具有通量高、经济、效率高和可定量检测的优势，对甲状腺肿瘤15个相关基因突变位点进行检测，可进一步全面理解PTC相关肿瘤生物学特性，为患者的诊断、预后和个体化治疗提供依据。